近期外泌體在腫瘤中的應用研究進展

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外泌體簡介

外泌體是由多種活細胞通過內吞-融合-外排等一系列生物學機制而形成的，具有脂質雙層膜結構的納米級微小囊泡。其最早是在1983年由Johnstone RM等研究羊成熟網織紅細胞過程中囊泡的形成時發現，在生理和病理條件下，都可以被一些細胞以胞吐的方式所釋放，如：免疫細胞、幹細胞、腫瘤細胞，且廣泛分布於外周血、尿液、唾液、腹水、乳汁、腦脊液等多種體液中。外泌體含有大量生物活性物質，如蛋白質、核酸、脂質、病毒和朊病毒等。這些成分在腫瘤微環境內相互作用，在腫瘤的發生髮展中發揮著重要的作用。

生物學特性

外泌體的密度為1.13～1.21g/mL，直徑約為30～100nm，在電鏡下觀察常呈杯型或雙凹碟型，在人體體液中常呈球型。通常採用超速離心法、過濾離心法、密度梯度離心法、色譜法、免疫磁珠法、聚乙二醇沉澱法等方法提取得到外泌體。外泌體含有大量生物活性物質，如蛋白質、核酸、脂質、病毒和朊病毒等。外泌體中脂質成分主要包括膽固醇、鞘磷脂、卵磷脂、磷酯醯絲氨酸、磷脂醯肌醇、神經節苷脂、聚甘油磷脂、飽和脂肪酸等，這些脂質結構具有提高細胞膜穩定性的作用。

外泌體中含有豐富的蛋白質，主要包括膜運輸和融合相關的蛋白質如Rab蛋白、GTP酶、膜聯蛋白等；細胞骨架成分如肌動蛋白、微管蛋白等；四跨膜蛋白，如CD9、CD63、CD81、CD82等；與外泌體形成相關的蛋白質如腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）、ALG-2相互作用蛋白X（ALix）、內體分揀轉運複合物（ESCRT）等；熱休克蛋白如HSP70、HSP60和HSP90。此外，外泌體還包含與細胞來源和組織類型相關的各種特異性蛋白，如主要組織相容性複合體Ⅰ（MHCI）、MHCⅡ、細胞黏附分子等。除蛋白質和脂質外，外泌體還包含大量的核酸，如信使RNA（mRNA）、微小RNA（miRNA）、長鏈非編碼RNA（LncRNA）和DNA等。

外泌體與腫瘤免疫治療

近日，來自加州大學舊金山分校（University of California, San Francisco）的研究人員在Cell雜誌上發表文章，發現腫瘤來源的外泌體上的PD-L1也參與了腫瘤細胞的免疫治療逃避。重要的是，對於一些PD-L1抗體治療效果不佳的腫瘤類型，通過抑制外泌體PD-L1分泌並同時進行PD-L1抗體治療，能夠實現良好的抗腫瘤免疫治療。

外泌體生物發生的關鍵酶包括NSMASE2（又稱SMPD3）和RAB27A，SMPD3促進囊泡內體的萌芽，RAB27A參與MVB與質膜的融合。因此，通過對這些酶調控可實現對外泌體在體內作用的干預。通過對Rab27a和nSMase2進行基因敲除以及從外源引入的外泌體方式，研究人員發現來自腫瘤細胞的外泌體PD-L1以免疫依賴的方式促進腫瘤生長。

實驗表明，外泌體PD-L1在引流淋巴結處抑制T細胞功能。外泌體PD-L1能夠促進PD-L1抗體治療的耐受性，在PD-L1抗體治療無效的前列腺癌中，PD-L1和外泌體促進前列腺癌細胞生長。值得注意的是，短期存在的外泌體PD-L1缺陷也會導致長期全身性的抗腫瘤免疫。外泌體PD-L1的這種作用在結直腸癌模型中也被證實。在結直腸癌中，PD-L1抗體與外泌體PD-L1分泌的抑制可共同實現腫瘤抑制效果。因此，外泌體PD-L1是一種新的免疫治療靶點，可以解決目前PD-L1抗體治療存在的耐受性問題。

外泌體與乳腺癌

Sirtuins是NAD 依賴性去乙醯化酶,其成員SIRT1失調的遺傳和代謝背景可能描述其腫瘤抑制功能。SIRT1的丟失與細胞周期缺陷、染色體不穩定性以及包括乳腺癌在內的幾種癌症類型中的DNA修復受損有關。

來自康奈爾大學的研究人員在近期的Developmental Cell雜誌上發表文章，鑒定了SIRT1的新型乳腺癌腫瘤抑制功能。研究人員報道SIRT1的損失損害溶酶體功能，導致促腫瘤發生外泌體和水解酶組織蛋白酶B的分泌增加。這些促腫瘤發生的外泌體可以重塑細胞外基質並增強培養的乳腺癌細胞的侵襲性。

該研究表明浸潤性乳腺癌細胞中SIRT1的缺失限制了溶酶體酸化並使MVB重新導向與細胞表面融合，從而增加了外泌體和水解酶的分泌。這些分泌的因子一起增加了侵襲性較小的癌細胞的侵襲和增殖。雖然SIRT1缺失細胞的分泌蛋白組的體內相關性未知，但證據表明SIRT1的喪失足以改變細胞間通訊和受體癌細胞的行為。該研究為癌症中的溶酶體生物學提供了新的見解，並開啟了關於外泌體成分包裝調控和外泌體對腫瘤微環境中受體細胞的影響的新見解。

外泌體在肺癌診斷中的作用

隨著對肺癌診斷方法研究的深入，目前國內外正在廣泛研究血清生物學標誌物聯合低劑量螺旋CT（LDCT）的肺癌診斷策略，通過血清生物學標誌物篩查肺癌是目前研究的熱點和趨勢。研究表明，外泌體分泌的miRNA和蛋白質可作為肺癌臨床應用中較理想的新的生物學診斷標誌物。

Giallobardo M等利用定量聚合酶鏈反應（qPCR）分析NSCLC患者血液中提取的外泌體所分泌的8個miRNA（miR-30B、-30C、103、-122、-195、-203、-221和-222）均與NSCLC相關；Cazzoli R等採用qPCR研究發現肺腺癌患者血液提取的外泌體所攜帶的4種miRNA（hsa-miR-378A、-379、-139-5P和-200B-5P）較健康吸煙者表達水平高，6種miRNA（hsa-miR-151A-5P、-30A-3P、-200B-5P、-629、-100和-154-3P）在肺腺癌中表達水平明顯高於肺肉芽腫患者；Rodriguez M等研究發現肺癌患者血液中外泌體含有的miR-122-5P表達量高於支氣管肺泡灌洗液（BALF）所分離的量。

Vanni I等研究發現肺癌患者血液外泌體來源的miR-25和miR-223的表達水平較正常人升高，而let-7F、miR-20B和miR-30E-3P的表達水平前者較後者明顯降低，這種差異性表達為肺癌的診斷帶來潛在應用價值。此外，外泌體蛋白質也可以作為肺癌標誌物。Huang SH等研究發現從NSCLC患者組織提取分離的外泌體蛋白質中約80%含有EGFR，在肺部慢性炎症患者中只有約2%的外泌體蛋白含有EGFR；另一項研究採用EV陣列分析法研究表明外泌體蛋白可作為晚期NSCLC的潛在診斷標誌物。通過免疫印跡和免疫組織化學法研究發現肺癌患者尿液來源的外泌體中的人富亮氨酸α2糖蛋白1（LRG1）是NSCLC非侵入性診斷的候選生物學標誌物。

Ueda K等通過對1369個外泌體蛋白進行質譜定量分析，發現CD91可作為鑒別肺腺癌特異抗原的外泌體，CD91聯合癌胚抗原（CEA）可作為肺癌診斷標誌物，兩者聯合檢測的靈敏度和特異度均高於單獨檢測CEA。以上研究表明，外泌體的相關miRNA和蛋白質檢測將為肺癌患者的早期發現、早期診斷提供更可靠的依據。

參考來源：

1.Mauro Poggio et al. Suppression of exosomal PD-L1 induces systemic anti-tumor immunity and memory. Cell 2019, 177, 414–427, April 4.

2.Latifkar A, Ling L, Hingorani A, Johansen E, Clement A, Zhang X, Hartman J, Fischbach C, Lin H, Cerione RA, Antonyak MA. Loss of Sirtuin 1 Alters the Secretome of Breast Cancer Cells by Impairing Lysosomal Integrity. Dev Cell. 2019 May6;49(3):393-408.e7. doi: 10.1016/j.devcel.2019.03.011. Epub 2019 Apr 11.

3.現代腫瘤醫學 2019 年 5月第27卷第9期，腫瘤醫學論壇綜合整理

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