一網打盡免疫組化（IHC）「疑難雜症」

作為一種經典的實驗技術，免疫組化（IHC）已成為實驗達人的必備技能之一。IHC的實驗流程和方法並不難，但在實驗過程中存在許多變數，容易遇到各種問題，因此，想要做出漂亮的實驗結果並非易事，正所謂「細節決定成敗」。下面小編將簡單介紹IHC的相關知識及在實驗過程中經常遇到的問題和應對策略，從此，讓成敗與細節Say「拜拜」！

免疫組化（IHC）檢測原理？

那麼什麼是免疫組化檢測？它的檢測原理是什麼？在進行深度剖析前，一些重要知識需要了解一下。免疫組化檢測即抗原-抗體的特異性結合反應以及顯色反應。通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、同位素、酶等）顯色來檢測組織切片中的抗原，從而對其進行定位、定性和定量。

顯色常用的酶為辣根過氧化物酶（HRP），常用的顯色底物為DAB（3,3』-二氨基聯苯胺），偶爾用AEC（3-氨基-9-乙基咔唑）。鹼性磷酸酶（AP或AKP）也是目前免疫診斷試劑最常用的標記酶之一，穩定性好、靈敏度高。

表1. 免疫組化（IHC）顯色系統的選擇

石蠟切片免疫組化（IHC）實驗流程

那麼，怎樣做出漂亮的染色結果呢？小夥伴們，莫急！為了有一個全局概念，我們先來看一下石蠟切片免疫組化的實驗流程吧！每一步都存在許多決定成敗的小細節，它們可以是陷阱，也可以是獲得好的實驗結果的基石。

脫蠟水化不充分

脫蠟水化的目的是使組織恢復到固定後的狀態，暴露抗原以便與一抗結合。通常用二甲苯或二甲苯替代物脫蠟，再用乙醇梯度洗脫二甲苯。若脫蠟和水化不全會引起染色不均勻（如下圖）、產生非特異性背景著色等問題。脫蠟不足是免疫組化失敗的最常見原因，原則上要徹底、完全脫去切片上的蠟。

內源性過氧化物酶

許多組織中存在內源性過氧化物酶，它通過與DAB結合而著色。在一抗孵育前，一般用3%H2O2滅活約10~20min，避免內源性過氧化物酶造成假陽性結果。H2O2需現用現配，且4℃避光保存，否則易引起非特異背景（如下圖）。H2O2孵育時間過長也會易引起脫片。部分組織還含有內源性鹼性磷酸酶,可用左旋咪唑進行滅活。

抗原修復

由於組織在甲醛或多聚甲醛固定過程中，會發生蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定簇、失去抗原性。通過抗原修復，可以使細胞內的抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。抗原修復技術通常分為蛋白酶誘導的表位修復（PIER）和熱誘導的表位修復（HIER）兩大類。

在PIER方法中，蛋白酶K、胰蛋白酶、糜蛋白酶和胃蛋白酶等蛋白水解酶可以使隱藏的抗原表位暴露，恢復其與抗體的結合。PIER的缺點在於恢復免疫反應性的成功率低，且有可能破壞組織形態和目的抗原。因此，需要選擇性使用，嚴格控制濃度和作用時間。

HIER是在脫蠟入水後，將組織切片浸沒在抗原修復液中並加熱。修復液的主要成分為檸檬酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、去垢劑和螯合劑。最常用的修復液為pH 6~10的檸檬酸鹽溶液和EDTA溶液。HIER對時間、溫度、緩衝液和pH特別敏感，精確控制溫度和時間是達到最佳修復的關鍵。總體來說，HIER的成功率比PIER高得多。

免疫組化染色的常見問題（部分）及對策

免疫組化（IHC）中存在的細節性問題「千千萬」，每一種都有可能影響實驗的成敗，由於篇幅限制，這裡我們僅簡單列舉幾種免疫組化染色中常見的問題和解決方法，如果想了解更多關於IHC的相關問題，可關注文末驚喜彩蛋，免疫組化「疑難雜症」盡可一網打盡！

表2.免疫組化（IHC）染色的常見問題（部分）及對策

怎麼？還是無法拯救你的免疫組化（IHC）？

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直播內容簡介：

病理切片染色的規範操作流程包括取材、固定、脫水、包埋、切片、染色、結果分析等，每個步驟都有各自的難點和注意事項。本次講座主要涉及組織預處理方法和注意事項，以及石蠟切片的免疫組織化學染色（IHC）技術的原理、操作流程和結果分析等經驗分享。

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