生物物理所等揭示anti-CRISPR沉默CRISPR-Cas9系統的分子機理

近日，中國科學院生物物理研究所王艷麗課題組和加拿大多倫多大學Karen Maxwell課題組的合作論文Inhibition of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complex assembly by anti-CRISPR AcrIIC2 在《自然-通訊》（Nature Communications）雜誌在線發表。該工作報道了2.45埃的apo AcrIIC2和2.28埃的結合了Neisseria meningitides Cas9 (Nme1Cas9) BH domain的AcrIIC2複合物晶體結構，結合體內和體外實驗，系統闡述了anti-CRISPR蛋白AcrIIC2沉默CRISPR-Cas9系統的分子機理。王艷麗課題組一直致力於CRISPR-Cas系統抗病毒作用機理的研究，前期研究揭示了一系列重要的CRISPR-Cas系統的作用機理（Nature 2014, Cell 2015, Cell Res. 2016, Cell 2017a, Cell 2017b, Mol. Cell 2017, Cell 2018, Mol. Cell 2019, Cell 2019）。

CRISPR/Cas系統是廣泛存在於細菌和古菌中的抵抗病毒和外源質粒入侵的獲得性免疫防禦系統。CRISPR-Cas系統分為兩大類。第一大類CRISPR-Cas系統由多亞基組成的效應複合物（如Cascade，Csm complex等）發揮功能；第二大類是由單個效應蛋白（如Cas9, Cas12，Cas13等）來發揮功能。Cas9具有RNA介導的DNA內切酶和RNA內切酶活性。由於可以特異性識別、結合、切割DNA，且具有可編程性，Cas9被廣泛運用於基因編輯和基因表達調控領域。2017年，Karen Maxwell課題組報道了3個來自於致病菌Neisseria meningitides 的anti-CRISPR蛋白，並命名為AcrIIC1，AcrIIC2，AcrIIC3。這是首次發現的可以抑制CRISPR-Cas9系統的anti-CRISPR蛋白。結構和功能研究表明，AcrIIC1通過和Cas9的HNH 結構域催化中心結合，抑制Cas9的基因編輯活性。

該研究中，研究人員通過生化實驗發現AcrIIC2和Nme1Cas9結合後，可以抑制sgRNA（由crRNA和tracrRNA融合而成）的結合，從而使Nme1Cas9的功能被抑制。研究人員隨後解析了2.45埃的apo狀態AcrIIC2晶體結構。結構發現AcrIIC2應該是一個dimer。兩個AcrIIC2結合形成一個帶負電荷的口袋，這提示AcrIIC2可能和帶正電荷的BH domain結合，從而發揮抑制功能。研究人員將複合物Nme1Cas9-AcrIIC2用蛋白酶預處理，收到了解析度高達2.28埃的晶體衍射數據。解出來AcrIIC2 與Nme1Cas B H複合物結構；功能實驗進一步驗證AcrIIC2和sgRNA競爭性地結合Nme1Cas9 BH 結構域。

王艷麗和Karen Maxwell為論文的共同通訊作者。Karen Maxwell課題組的Annoj Thavalingam、Bianca Garcia，王艷麗課題組的博士生程志、黃雪為論文的共同第一作者。該研究得到科技部、國家自然科學基金以及中科院的資助，上海同步輻射光源（SSRF）為該研究提供了重要的技術支持。

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