我國科學家實現小鼠個體水平的靶向遺傳篩選

近年來，CRISPR-Cas9技術介導的突變篩選在小鼠和人細胞中已被廣泛應用，而實現高效的小鼠個體水平遺傳篩選對哺乳動物功能基因組研究具有重要意義。

中國科學院分子細胞科學卓越創新中心（生物化學與細胞生物學研究所）李勁松和鄒衛國研究團隊合作應用孤雄單倍體胚胎幹細胞（「人造精子細胞」）介導的半克隆技術，結合CRISPR-Cas9介導的基因編輯技術，成功實現了小鼠骨發育相關基因的個體水平遺傳篩選，並揭示Irx5基因作為骨發育過程中重要調控因子，通過抑制PPARγ分子促進成骨分化並抑製成脂分化，為小鼠發育過程中關鍵基因功能研究開闢了新的途徑。該研究成果7月2日在線發表於《美國科學公共圖書館·生物》（Plos Biology）。

李勁松研究員告訴《中國科學報》記者，科研人員基於體外成骨分化過程高通量測序分析數據，篩選了72個潛在骨發育相關基因，建立了一個攜帶216個嚮導RNA（sgRNA）的單倍體幹細胞庫（即「人造精子細胞庫」），其中的每個「人造精子」一般都攜帶一個針對不同基因的「sgRNA導航器」，精確定位到靶基因上並對其進行基因編輯。李勁松解釋道，「我們將這些攜帶修飾基因的『人造精子』逐一注射入小鼠MⅡ期卵母細胞，一個月不到，就獲得了400多隻攜帶不同突變基因的半克隆小鼠。」

鄒衛國研究員說：「我們在這些小鼠出生後，就開始對其進行骨骼整體染色分析，依據骨骼大小、鈣化、顱頂骨、長骨、椎骨形態等指標對每隻小鼠進行評分。與此同時，我們利用每隻小鼠攜帶的『sgRNA導航器』對骨發育異常的小鼠所攜帶的『靶基因』的測序分析，最終確定其是否存在基因突變。」

「我們從72個候選基因中篩選出了4個參與骨發育調控的關鍵基因 。」鄒衛國進一步介紹說，「在這4個關鍵基因中，基因Zic1和Clec11a被其他研究證實參與骨發育調控，而基因Rln1和Irx5在小鼠骨發育過程中的功能尚不明確。為了驗證它們在小鼠骨骼發育中的調控機制，我們構建了基因Rln1和基因Irx5敲除的小鼠模型來驗證這兩個基因在骨發育過程中的作用，發現敲除了Rln1基因的小鼠在出生時骨骼較小，而成年後差異不顯著；敲除基因Irx5的小鼠在出生時和成年後骨骼較小和骨量下降特徵均很顯著，同時伴隨著骨髓中脂肪形成增加的特徵。進一步的分子機制研究表明，IRX5通過抑制PPARγ通路的激活，促進成骨分化同時抑制脂肪生成。」

「這項研究的理論價值在於首次實現了小鼠個體水平骨發育靶向遺傳篩選。」談及對於未來的臨床應用價值，鄒衛國表示，「我們希望我們的基礎研究能為臨床服務，為骨質疏鬆症的藥物研發和臨床應用等提供理論支撐。」

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