2019過半了，今年基因編輯領域有哪些重要進展？

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CRISPR技術能精確、有效地在活的真核細胞中對基因組進行編輯。該方法以風暴般的速度席捲了整個科學界。2016年，中國科學家首次利用CRISPR基因編輯技術，針對晚期非小細胞肺癌患者開展了人體臨床試驗，標誌著CRISPR-Cas9技術從此開啟了人類基因編輯的新紀元，自此相關研究進行地如火如荼。讓我們來看看，到目前為止今年關於CRISPR的研究進行地如何。

CRISPR基因編輯成功治癒先天性失明

1月份， Nature Medicine 雜誌發表題為Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10 的研究論文。該研究使用Editas Medicine公司（創始人為張鋒）開發的編號為EDIT-101的CRISPR/Cas9基因療法，去除了由CEP290基因中的IVS26突變產生的異常剪接供體，從而使CEP290基因恢復正常表達，成功恢復了Leber先天性黑蒙症10型的視力。這一成果也表明基於CRISPR的基因編輯療法在治療遺傳疾病方面的可行性。

先天性黑蒙症，是發生最早、最嚴重的遺傳性視網膜病變, 出生時或出生後一年內雙眼視錐細胞功能完全喪失，導致嬰幼兒先天性盲。Leber先天性黑蒙10型（LCA10）由CEP290基因中的雙等位基因功能喪失突變引起。最常見的LCA10突變位點是IVS26，位於內含子26內的腺嘌呤至鳥嘌呤點突變，其突變產生新的剪接供體位點，導致轉錄提前終止。

由於CEP290基因的編碼序列長達7.5kb，遠超AAV病毒的包裝能力（4.7kb），所以無法通過AAV遞送正確編碼的CEP290基因的方式來治療。Editas Medicine開發的特異於CEP290 IVS26突變的基因編輯策略，使用AAV5載體通過視網膜下注射將saCas9和CEP290特異性gRNA遞送至感光細胞，通過雙gRNA分別靶向突變內含子區域的上下游，直接將突變內含子區域整體刪除或倒位，從而恢復CEP290基因的正常表達。這巧妙的避免了AAV病毒包裝能力有限的局限，也為這一類遺傳病的治療帶來了新的思路。

第三代CRISPR-Cas系統

今年1月份，張鋒發表在《Nature communication》上的文章Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome提到，他們開發了第三種基因編輯工具CRISPR-Cas12b，該工具經過改造後也能在哺乳動物和人體中進行有效的基因編輯。

之前的研究表明，核酸酶 (AacCas12b)保持體外切割活性的溫度範圍是40℃至55℃，這不適合於哺乳動物基因組編輯。研究人員用BLAST找出了27個V–B型的Cas12b蛋白，排除了來源於嗜熱菌和先前研究過的還剩14個候選者，最終發現四個Cas12b (AkCas12b、BhCas12b、EbCas12b、LsCas12b)可能有活性。體外實驗表明，AkCas12b和BhCas12b在37℃仍具有較強的DNA切割活性。

通過一系列實驗，研究人員構建了酶活最高的突變體BhCas12b v4（K846R/S893R/E837G），其具有特異性高、安全性好、基因組靶向範圍廣等優點，有望開發出新一代安全高效的基因編輯工具。

改良基因魔剪助力精準治療耳聾

前不久，哈佛醫學院和波士頓兒童醫院的一支聯合研究團隊，利用優化的CRISPR-Cas9基因編輯系統，在耳聾小鼠模型上精確識別並修正內耳的致聾突變，最終幫助小鼠保留聽力，相關研究發表在《Nature Medicine》雜誌上。

「貝多芬小鼠」是攜帶有缺陷Tmc1基因的小鼠。這些小鼠Tmc1基因的DNA序列中有一個錯誤——腺嘌呤A取代了胸腺嘧啶T，這中錯誤會導致小鼠聽力受損。在人體中，如果Tmc1基因發生突變會導致聽力逐漸喪失。

哈佛醫學院Blavatnik研究所的科學家改進了傳統的CRISPR -Cas9系統，能更好地識別引起耳聾的基因突變。研究人員首先對含有Tmc1基因變異的細胞進行觀察發現，修改後的基因編輯系統能夠準確區分突變的DNA和Tmc1基因副本中正常的DNA。進一步分析顯示，在包含有一個缺陷基因和一個正常基因的細胞中，至少有99% 的CRISPR-Cas9切割只發生在缺陷基因拷貝中。

他們將基因編輯療法注射到小鼠的內耳中，並進行了DNA分析，結果表明基因編輯活動只發生在貝多芬缺陷小鼠的內耳細胞中。在沒有基因變異的小鼠內耳細胞中未檢測到基因編輯的跡象，這一發現證實了該工具的準確性。

進一步檢測發現，接受基因編輯治療兩個月後，貝多芬小鼠的聽力明顯好於未接受基因突變治療的小鼠。而如果不進行治療，貝多芬小鼠會在在6個月大時就完全失聰。這是繼治療先天性失明後，CRISPR基因魔剪在遺傳性疾病治領域的又一突破。

基因編輯技術消滅HIV病毒

近日發表在《Nature Communications》雜誌的一項研究顯示，美國一個跨多學科的科學家團隊，將抑制艾滋病毒的藥物和 CRISPR-Cas9 基因編輯技術結合，在 9 只小鼠的基因組中完全消除了艾滋病毒。目前，艾滋病毒的治療方法抗逆轉錄病毒療法（ART）能抑制病毒自我複製，但無法完全消除。而這種新療法，則首次從活體動物的基因組中消除了 HIV-1 的 DNA。

研究人員使用了兩種不同的方法來對抗病毒：CRISPR-Cas9療法和LASER（long-acting slow-effecting release）ART療法。LASER ART是ART療法的進階版，能夠使病毒在較低水平上長時間複製，然後將抗逆轉錄病毒藥物儲存在納米晶體中，在病毒所在位置緩慢釋放藥物。

分別用LASER ART療法、CRISPR-Cas9療法以及兩者結合這三種療法治療感染HIV的小鼠八周後，研究者發現超過30%接受了ART療法和CRISPR-Cas9療法的小鼠體內任何組織中都沒有檢測到HIV。而單獨接受兩種療法的小鼠體內仍然可以檢測到HIV。

研究人員稱，如果按順序進行抑制HIV複製的治療和基因編輯治療，就可以從受感染動物的細胞和器官中清除HIV。

Cas9切割DNA的高清三維圖像首次被捕獲

近日，來自不列顛哥倫比亞大學（UBC）研究團隊，使用低溫電子顯微鏡（cryo-EM）首次在精確切割DNA鏈的過程中捕獲了酶的高解析度三維圖像。這顯示了有關基因編輯工具CRISPR-Cas9如何工作的信息，將有助於研究人員開發出更高效、更精確地操作以改變目標基因的工具。

研究者將Cas9複合物快速冷凍並使用cryo-EM成像，最終捕捉了Cas9在與核酸結合過程中的三種不同的結構排列的快照。其中兩種中，目標DNA被切割後但酶仍然沒有解離。狀態II和III顯示在Cas9催化後立即發生的重排並隨之轉化為與後續產物結合的中間體。

該研究提出了Cas 9-sgRNA和DNA複合物以及Mg2 存在時的結構。在溶液中捕獲了三種不同的狀態，提供了Cas9切割其DNA靶標的機制。並且基於這些結構發現，提出了Cas9催化的RNA指導的DNA切割的修訂模型，為以後開發更高效和精準的基因編輯工具提供了理論支持。

新型RNA單鹼基編輯器

DOI：10.1126 / science.aax7063

近日，張鋒團隊在 Science 雜誌發表了題為A cytosine deaminase for programmable single-base RNA editing的文章，他們開發了名為RESCUE的RNA單鹼基編輯器，可以通過靶向特定的RNA殺死致病蛋白。

RESCUE編輯器可以靶向任何特定RNA，通過改進的ADAR2組件執行C-to-U的單鹼基編輯。研究人員將其引入人體細胞，發現它們可以靶向細胞中的天然RNA，以及合成RNA中的24個臨床相關突變。

實驗中，研究團隊利用RESCUE系統對編碼APOE4的RNA進行編輯。之前的研究表明，APOE4是導致阿爾茨海默症的風險因子。研究發現，APOE2蛋白與之相似但是相對無害，兩者之間只有兩個差異（APOE4中的C與APOE2中的U）。研究人員通過RESCUE系統，他們成功地將APOE4 RNA分子中的兩個字母從C變成了U，從而將風險因子轉變成了無害蛋白。

RESCUE極大地擴展了基因編輯工具可以應用的領域，包括蛋白質中的可修飾位置，像是磷酸化位點。這些位點在蛋白質活動中起著開關的作用，在信號分子和癌症相關通路中尤為明顯。為了促進將RESCUE推向臨床應用，張鋒團隊計劃免費分享RESCUE系統，讓全世界更多研究人員能夠使用它來更好地了解引起疾病的基因突變。

致敬科學家們！

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