《新英格蘭醫學雜誌》綜述：基因治療

NEJM醫學

基因治療為傳統療法無效的疾病提供了可選擇的治療方案。自2016年以來，歐洲EMA和美國FDA已批准總共6種基因治療產品：兩種屬於CAR T療法，用於治療血液腫瘤；4種用於治療嚴重單基因遺傳病，包括β地中海貧血、一種罕見的視力減退、脊髓性肌萎縮和一種罕見的原發性免疫缺陷。

目前有800多種細胞和基因治療項目正在臨床開發中（其中包括進行性假肥大性肌營養不良和亨廷頓病等既往無法治療的疾病）。

2019年8月1日，《新英格蘭醫學雜誌》發表了題為《基因治療》的綜述，介紹了基因治療的基本原理、臨床應用以及亟需解決的挑戰等，重點關注單基因疾病（High KA, Roncarolo MG. Gene therapy. N Engl J Med 2019;381:455-64）。

基本原理

基因治療的目標是實現治療性基因或「轉基因」的持久表達，在最少不良事件的前提下使其水平足以改善或治癒疾病癥狀。

基因治療有兩種基本方案：

1. 將整合載體導入前體細胞或幹細胞內，使基因可以傳給每個子細胞（載體被設計為可以在患者染色體的一個或多個基因座整合）

圖1. 基因治療的離體遞送

2. 通過非整合載體將基因遞送到長期存活的有絲分裂後細胞或緩慢分裂的細胞內，確保該基因在細胞存活期間持續表達

圖2. 基因治療的體內遞送

第2種方案不需要將治療性DNA整合入患者細胞的染色體，而是轉移的DNA在染色體外達到穩態。幹細胞轉導通常為離體操作，並且需要整合載體，而將基因遞送給長期存活的有絲分裂後細胞的過程通常是通過體內基因遞送的方式實現。

將基因治療應用於遺傳病，絕不僅僅是確定致病基因。轉基因（或其蛋白質產物）必須被遞送到生理上相關的一個或多個靶組織，必須穩定表達，並且絕不能干擾這些細胞的功能完整性。

安全性

整合載體（例如逆轉錄病毒載體）的主要風險來自其插入誘變潛力，即載體插入細胞DNA並破壞該DNA的功能元件（例如基因）。體內給葯載體的主要風險來自對載體的免疫應答。對於這兩種風險，前者已通過製造更安全的（慢病毒）載體來降低或規避，因為慢病毒和腺相關病毒（AAV）載體不具有持續複製的能力；而後者則已通過輔助性免疫調節藥物來降低。

表1. 基因治療的潛在併發症和觀察到的併發症*

* AAV表示腺相關病毒，SCID表示重度聯合免疫缺陷。

離體基因治療的代表：地中海貧血和鐮狀細胞貧血

近期的β地中海貧血患者幹細胞基因治療的1期和2期試驗表明其可安全地降低患者輸血頻率。臨床療效與基因轉移效率、轉導細胞中的前病毒平均拷貝數以及經基因矯正的造血幹細胞劑量相關，與血紅蛋白合成需求呈負相關。

這兩項試驗之一以及正在進行中的3期研究（關於編碼變異βA-T87Q-珠蛋白基因的載體）表明，患者在長達56個月期間不需要輸血，被視為療效持久，因此EMA有條件地批准了Zynteglo（藍鳥生物）用於治療≥12歲，且不屬於β0/β0基因型的輸血依賴型β-地中海貧血患者。靶向不同基因、利用不同載體治療鐮狀細胞性貧血的4項基因治療試驗正在進行中（ClinicalTrials.gov註冊號為NCT03282656、NCT02247843、NCT02186418和NCT02151526）。

表2. 基因治療的監管審批里程碑

體內基因治療的代表：血友病

體內基因轉移（將載體直接注射到患者體內）大多使用AAV載體作為基因遞送載體。重組AAV載體是利用一種非致病性無包膜細小病毒構建而成。製備載體的方式是將由適當啟動子驅動的治療性基因置於兩個非編碼病毒包裝信號之間（圖2），但當序列長度超過5 kb時，將轉基因包裝入載體中的效率急劇下降，這是AAV載體遞送系統的少數幾個局限性之一。大部分AAV載體DNA在細胞內以穩定附加體的形式持續存在（未整合入患者基因組）。因此，AAV載體發生插入誘變的風險低。

以肝臟或其他器官為目標對AAV載體進行的全身性血管內給葯已經在數種重度遺傳病中獲得了正面的臨床結局。對重組AAV載體血管內給葯開展的一項早期試驗納入了男性重度血友病B患者。

該試驗確定了兩個主要的免疫障礙：

1. 20%~40%成人存在AAV抗體，它可中和載體，進而降低療效

2. 在輸入載體後4~12周發生的對AAV衣殼的遲髮型細胞免疫應答，會導致轉導細胞遭到破壞和喪失療效

上述兩個問題的根源是人類是野生型AAV的天然宿主，因此可能攜帶兒童期呼吸道感染後產生的抗體或記憶T細胞。

目前，有AAV抗體的患者無法接受治療。而遲髮型細胞免疫應答的臨床表現是無癥狀、自限性的轉氨酶水平升高，同時來自轉基因的因子Ⅸ表達逐漸喪失。對外周血單核細胞所做的檢測表明，它們針對AAV衣殼肽分泌干擾素-γ，因此人們認為通過藥物進行免疫抑制可能有助於AAV載體發揮療效，因為衣殼肽的存在時間應該很短。

這一看法被另一項試驗證實。該試驗中發生轉氨酶水平升高或因子Ⅸ水平降低的參與者接受了逐漸減量的糖皮質激素治療。試驗中輸入最大劑量糖皮質激素的6名參與者在3年觀察期內表現為因子Ⅸ長期表達，並且出血事件和因子Ⅸ用藥量均減少90%。

之後的一項試驗採用了因子Ⅸ的高比活性變異體，因而可以採用較小劑量（早期試驗中所採用的大劑量的1/4），並且達到的因子Ⅸ平均活性水平要高得多，而免疫應答的發生率較低，這可能是因為免疫應答具有劑量依賴性。

由於可以整合入AAV載體的cDNA長度存在限制，因此對於由F8這種非常大的基因突變引起的血友病A，研究者花了較長時間才啟動針對基因治療的臨床試驗，而正在進行的臨床試驗利用了編碼截短因子Ⅷ的cDNA。

近期的一項試驗對其前9例患者的報告顯示，在接受最大劑量載體的7名男性中，20周時有6名的因子Ⅷ活性水平為12%~200%以上（50%~150%代表正常活性水平），但其隨時間推移而下降（隨訪3年以上）。因子Ⅷ水平的下降，以及因子Ⅷ的錯誤摺疊傾向（錯誤摺疊可能導致細胞應激）令人質疑血友病A患者可否實現持久應答。儘管如此，在2~3年內觀察到的患者年出血率的降低仍然是穩健的。

展望

對於離體基因治療，未來的目標包括改進慢病毒載體的設計，以進一步提高安全性和對外源基因的控制，高效大規模製備並分析鑒定載體，以及開發毒性較低且有助於穩定植入經過基因矯正的幹細胞的預處理方案，包括用基於抗體的方案代替化療預處理，從而減少併發症。

對於應用AAV載體進行的體內基因治療，未來10年的努力將集中於闡明和管理人體對載體的免疫應答，並繼續改進AAV載體的設計和開發，從而提高靶向能力並採用較小劑量達到體內療效。

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