「拯救貝多芬」：改良版 CRISPR 技術可有效治療小鼠進行性耳聾

改良版基因編輯技術有效治療小鼠進行性耳聾，且未見脫靶效應

圖片來源：Pixabay

來源Harvard Medical School

翻譯 阿金

審校 嚴冰冰、李光昭

編輯 李光昭

哈佛醫學院（Harvard Medical School）和波士頓兒童醫院（Boston Children"s Hospital）的科學家們通過一種新型基因編輯方法，成功治癒患進行性聽力喪失的小鼠，且治療後未檢測到明顯的脫靶效應。

這種新方法於 7 月 3 日發表在《自然·醫學》（Nature Medicine）上。該方法優化了傳統的 CRISPR-Cas9 基因編輯系統，使其更加精準，能夠更好地識別患病小鼠體內的致病突變基因。科學家可利用這一改良工具選擇性地關閉聽力缺陷基因Tmc1，同時保留健康的基因拷貝。

研究人員在報告中指出，值得一提的是，該系統成功地在小鼠基因組 30 億個鹼基中，準確識別出了單個缺陷基因。

研究人員謹慎地表示，這樣高精準度的基因編輯療法，可以應用在人類身上之前，還有很多的研究工作需要完成。然而，他們也指出，該研究具有里程碑式的意義，因為它極大地提高了標準基因編輯技術的有效性和安全性。

該研究負責人之一、哈佛醫學院布拉瓦特尼克研究所（Blavatnik Institute at Harvard Medical School）的貝塔雷利轉化醫學教授 David Corey 指出，「我們的結果證明，目前改善過的 CRISPR/Cas9 基因編輯技術，靶向能力更強，達到了前所未有的識別度和準確度。」

貝多芬突變

每個人都攜帶同一個基因的兩份拷貝，分別來自父母雙方。在許多情況下，一個正常基因拷貝足以保證該性狀的正常功能，保護個體免於發病。但在顯性遺傳病中，單個缺陷基因就會導致個體患病。

實驗小鼠。圖片來源： filin174 / Adobe Stock

攜帶錯誤表達的Tmc1基因的小鼠被稱為貝多芬小鼠，因為它們的發病過程與著名音樂家貝多芬聽力逐漸喪失的過程十分相似。不過，貝多芬耳聾的原因仍然是個謎。

在小鼠體內，貝多芬缺陷的標誌是Tmc1基因序列的單個鹼基錯誤：鹼基 T 被替換為了鹼基 A 。一個鹼基的變化導致了個體由正常聽力到耳聾的病變。在人類中，「貝多芬突變」會導致患者出生後發生進行性聽力下降，最終在 25 歲左右發展為嚴重的耳聾。

關閉或者沉默發生突變的Tmc1基因或許可以保護動物的聽力，但是，如何在不影響健康基因的前提下做到呢？

雙重鎖定，克服阻礙

傳統的 CRISPR-Cas9 基因編輯系統通過嚮導分子 gRNA 識別突變的 DNA 序列，目標序列被確定後，DNA 核酸內切酶 Cas9 就會進行剪切。

然而，目前這一技術的準確度不夠。這是因為引導 Cas9 核酸酶到目的序列的嚮導 RNA 分子，及負責切割的 Cas9 核酸酶都無法做到完全精準，可能會導致錯誤的序列剪切。

為了克服這一難題，研究人員採用了最初由哈佛醫學院的病理學教授 Keith Joung，和哈佛醫學院的病理學助理教授 Ben Kleinstiver 在馬賽諸塞州綜合醫院（Massachusetts General Hospital）共同開發的技術。該技術使用了改善後的 Cas9 內切酶——取自金黃色葡萄菌（Staphylococcus aureus），而不是傳統的釀膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）。

為了提高檢測和剪切的準確性，新的優化系統結合了兩個層面的目的基因識別：通過 gRNA 分子確定目的基因，同時通過改良的 Cas9 酶特異性錨定貝多芬小鼠攜帶的突變基因。這兩種識別方式的結合，確保了剪切酶可以只針對異常基因進行精確且有選擇性地剪切。

論文的第一作者 Bence Gyorge 說道：「我們利用該系統只識別突變 DNA 而不識別正常 DNA 的特性，使用雙重識別系統提高了它的準確性。這一方法在特異性識別突變基因的準確性上達到了前所未有的水平。」 Bence 在哈佛醫學院學習期間開展了該項研究，如今就職於瑞士巴塞爾的分子和臨床眼科學研究所（Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology）。

在最初的細胞水平實驗中，這一基因編輯技術可以準確識別出突變的Tmc1基因（貝多芬突變）和正常 DNA 片段。通過進一步分析顯示，在同時攜帶缺陷性基因和正常基因的貝多芬細胞中，99% 以上的剪切僅發生在有缺陷性基因上。

之後，研究人員又通過內耳注射，對攜帶貝多芬突變的小鼠和正常小鼠分別進行基因編輯治療。DNA 分析顯示，只有攜帶貝多芬缺陷基因的小鼠的內耳細胞中發生了基因剪切——再次印證了這一技術的準確性。

為了確認基因編輯療法不會干擾正常基因的功能，科學家以未攜帶貝多芬缺陷基因的小鼠作為研究對象，刺激其內耳中的聽覺細胞——毛細胞。結果顯示毛細胞未受影響，小鼠聽力反應正常——確認了基因編輯療法不會影響正常基因的功能。

讓貝多芬突變基因沉默

為了檢測該療法是否在動物體內有效，研究人員進行了聽力評估的金標準測試：聽性腦幹反應，這是一種聽覺誘發電位，可以反映出內耳毛細胞實際探測到並傳遞給大腦的音量。

通常，未經治療的貝多芬小鼠到 6 個月大就會完全失聰。相比之下，沒有遺傳缺陷的小鼠可以一直保持正常聽力，能捕捉到約 30 分貝的聲音——類似於耳語的音量。

以未接受治療且攜帶突變基因的小鼠為對照組，貝多芬小鼠的聽力情況在接受基因療法兩個月後有顯著改善，能聽到約 45 分貝的聲音——正常談話音量，或與未接受治療的小鼠相比，對聲音的敏感度提高了 16 倍左右。改善最多的貝多芬小鼠能夠聽到 25 到 30 分貝的聲音，基本與健康小鼠聽力水平無異。

綜上所述，新的基因療法有效關閉了缺陷基因的表達，避免了這一導致聽力快速喪失的疾病。

David Corey教授（左）和Jeffrey Holt教授（右）

圖片來源：Michael Goderre/Boston Children』s Hospital

因為該疾病的特徵是進行性聽力喪失，所以研究人員對基因治療進行了為期數月的效果評估。研究人員在小鼠出生之後不久進行治療，並對接受治療與未接受治療的貝多芬小鼠和正常小鼠，進行為期六個月、每四周一次的聽力水平測試。未經治療的貝多芬小鼠在第一個月內可以聽到低頻聲音，但對高頻聲音表現出明顯的聽覺損失，六個月時聽力完全喪失。與之相對的是，接受過治療的貝多芬小鼠幾乎能正常地聽到低頻聲音，甚至有些幾乎可以正常地聽到高頻聲音。

很重要的一點是，未攜帶遺傳缺陷的小鼠沒有因基因治療出現任何聽覺損失的現象。這一發現證明了該療法的安全性及選擇性靶向缺陷基因的能力。更鼓舞人心的是，一小群貝多芬小鼠在接受治療後近一年的時間裡，聽力幾乎穩定保持在正常水平。

因為貝多芬基因缺陷的特徵之一是內耳聽力細胞的逐漸退化和死亡，研究人員使用電子顯微鏡對這些重要細胞的結構進行了觀察。正如預期，在未治療的貝多芬小鼠耳內，聽力細胞隨著細胞結構的損傷而逐漸死亡。而在接受治療的貝多芬小鼠和健康小鼠耳內，都保留有正常數量的聽力細胞，細胞結構完整或近乎完整。

在最後一項試驗中，科學家們在攜帶貝多芬突變的人類細胞中測試治療效果。DNA 分析表明，這一基因療法只對發生突變的Tmc1基因進行了基因剪切，沒有影響正常基因。

由於這項技術能夠識別單個鹼基的突變，該方法也有望於治療同樣由單個鹼基突變引發的其他 15 種遺傳性耳聾。

除此之外，研究團隊還提到，這項技術還可以應用於其他由單個鹼基突變引發的顯性遺傳病。為驗證該假設，科研人員搜索了聯邦 ClinVar 資料庫——一個包含了與所有已知人類疾病相關的基因突變的美國國家資料庫。分析表明，基於該技術的特異性，它能夠正確地識別出 3759 種缺陷性基因突變，占人類顯性突變數量的五分之一。

該研究的另一位負責人、哈佛醫學院教授、麻省兒童醫院神經病學家 Jeffrey Holt 補充說：「我們相信，我們的研究敲開了通向超級靶向療法方向的大門，這種方法可治療大量由單基因缺陷引發的遺傳病。這是真正意義上的精準醫療。當然，這只是漫長探索旅程的第一步。但實驗結果已經證實了我們的理論：這種高度特異性、高度靶向性的治療方法能夠通過進一步發展，選擇性地沉默攜帶單鹼基突變的基因，有望於治療很多其他形式的人類疾病。」

該研究的共同研究人員包括: Carl Nist-Lund, Bifeng Pan, Yukako Asai, K. Domenica Karavitaki, Benjamin Kleinstiver, Sara Garcia, Mikolaj Zaborowski, Paola Solanes, Sofia Spataro, Bernard Schneider, Keith Joung 和 Gwenaelle Geleoc。

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！