靶向蛋白質降解技術助力攻克三陰性乳腺癌

　　來源：學術經緯

　　乳腺癌作為中國女性第一高發惡性腫瘤，發病率呈逐年上升趨勢。隨著早期篩查技術和綜合治療技術的發展，乳腺癌的療效得到顯著的改善。根據美國國立癌症研究所（NCI）的數據，乳腺癌的五年存活率已達89.9%。儘管這一數字十分可觀，但其中一種亞型——「三陰性乳腺癌（TNBC）」卻仍舊存在預後差、複發率高、存活率低的問題。這類病例佔全部乳腺癌患者的12%~20%。

　　乳腺癌細胞一般以雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體-2（HER2）作為分類依據。對上述某些受體為陽性的患者，改變體內的激素水平，或者施用相應的受體抑製劑，可以抑制乳腺癌細胞和腫瘤的生長，是極為有效的輔助治療手段。而對三種受體均缺乏的三陰性乳腺癌，意味著針對這幾種受體的內分泌治療和靶向治療均無效。手術輔助放、化療仍舊是治療這種癌症的主要手段。

▲圖片來源：123RF

　　人們在很多癌細胞（包括三陰性乳腺癌）中都發現了過量表達的組蛋白賴氨酸甲基轉移酶EZH2。今日，紐約西奈山伊坎醫學院（Icahn School of Medicine at Mount Sinai）的金堅教授課題組與Ramon Parsons教授課題組合作，從這一甲基轉移酶入手，首創性開發出EZH2的高效、高選擇性且安全的降解劑MS1943，試圖以此攻克三陰性乳腺癌的治療難題。

　　EZH2是多梳抑制複合體2（PRC2）的重要催化單元，通過催化組蛋白H3第27位賴氨酸（H3K27）的甲基化來調控基因的表達、識別和發展。在以往的研究中，研究人員往往將著眼點放在如何調控EZH2的催化性能。因而之前發展的EZH2抑製劑主要用於抑制H3K27的過量甲基化，對依賴這一過程的瀰漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL）、惡性橫紋肌樣瘤（MRT）等癌細胞有很好的抑制作用。研究表明，EZH2除了能催化H3K27的甲基化，還有其他生理作用。在乳腺癌細胞中，EZH2蛋白含量越高，往往預後越差。而乳腺癌細胞卻不依賴於下游H3K27的過量甲基化，因而EZH2抑製劑對這種癌細胞無能為力。

　　作者認為，EZH2蛋白的降解或許是治療乳腺癌的一種有效手段。遵循這一思路，MS1943成功地選擇性降解了EZH2，體外和小鼠體內的活性測試表明，其能有效地殺滅三陰性乳腺癌細胞，抑制腫瘤生長。相關結果發表在Nature旗下子刊Nature Chemical Biology上。

▲圖片來源：參考資料[1]

　　金堅教授課題組長期致力於組蛋白甲基轉移酶抑製劑和降解劑的開發。在此項研究中，他們將之前發展的EZH2蛋白抑製劑C24略加改造，修飾一個親脂性的金剛烷標籤，就能利用這個金剛烷標籤將EZH2蛋白的空間摺疊構象改變，使其被細胞內的蛋白降解酶識別並降解。

　　▲MS1943與C24的分子結構（圖片來源：參考資料[1]）

　　研究者首先使用對EZH2敏感的MDA-MB-468三陰性乳腺癌細胞，表徵了MS1943在體外對EZH2蛋白的降解活性。在MS1943的作用下，EZH2的含量明顯下降，同時，作為EZH2催化功能產物的H3K27me3蛋白含量隨之下降。MS1943具有很高的選擇性，細胞內的其他蛋白如EZH1以及和EZH2同屬多梳抑制複合體2（PRC2）的SUZ12和EED都沒有被降解。作為對照，C24高效抑制了EZH2的催化活性，因而H3K27me3蛋白表現出了比MS1943更低的水平；而EZH2蛋白本身和其他蛋白含量都沒有明顯的降低。

　　之後，他們考察了MS1943和C24對癌細胞增殖的影響。如下圖所示，MS1943在2.2 μM濃度下可以殺滅50%的癌細胞（GI50）；而C24雖然能更有效地抑制EZH2的催化活性，其對癌細胞增殖的抑制作用並不明顯，GI50超過了8 μM。這與前人的研究結論相吻合，即乳腺癌細胞依賴EZH2蛋白催化作用之外的其他生理功能。活細胞的結晶紫染色試驗和死亡細胞的DRAQ7染色試驗得到了更直觀的結論：在2~4 μM的濃度下，MS1943顯著抑制了MDA-MB-468細胞的增殖。

▲MS1943與C24對MDA-MB-468細胞作用效果的對比（圖片來源：參考資料[1]）

　　為了證明MS1943是通過降解EZH2導致的細胞毒性，而不是影響了細胞的其他生理功能，研究者使用CRISPR/cas9技術敲除了兩種對MS1943敏感的三陰性乳腺癌細胞（BT549 和MDA-MB-468）的EZH2基因。作為對照，他們也敲除了MDA-MB-231這種對MS1943不敏感的癌細胞EZH2基因。如果假設成立，即MS1943是通過降解EZH2來殺滅細胞，那麼對MS1943不敏感的細胞對EZH2含量的降低也不敏感。結果與預期十分吻合：BT549和MDA-MB-468這兩種對MS1943敏感的細胞增殖受到了很大影響，而MDA-MB-231的細胞增殖不受影響。研究者還通過不同程度抑制MDA-MB-468細胞EZH2基因的表達水平來觀察EZH2蛋白水平對細胞增殖的影響：EZH2基因表達越低，細胞增殖的抑制也越嚴重。

▲EZH2基因敲除或下調對不同細胞增殖的影響（圖片來源：參考資料[1]）

　　以上研究結果表明，MS1943對某些EZH2敏感的腫瘤具有潛在的治療效果。

　　隨後，他們表徵了MS1943在體內的生理活性。通過給移植了MDA-MB-468腫瘤的小鼠每日腹腔注射一次150 mg/kg劑量的MS1943，腫瘤生長得到完全抑制。在這個劑量下，小鼠並沒有表現出體重降低等藥理毒性。解析小鼠腫瘤和血漿中的MS1943的含量，其濃度都超過了有效抑制腫瘤細胞的增殖濃度（GI50）。這些事實說明在體內有效劑量的MS1943作用下，小鼠是安全的。

▲MS1943體內抑制腫瘤生長的效果（圖片來源：參考資料[1]）

　　在文章的最後，研究者證明，MS1943通過降解EZH2導致內質網功能持續紊亂，未摺疊蛋白質應答過度激活，從而啟動癌細胞凋亡程序。這是MS1943有效殺滅三陰性乳腺癌細胞的機制。

　　EZH2蛋白存在於多種癌細胞中，曾得到了生物醫藥學界的廣泛關注，一系列針對肉瘤、淋巴瘤、惡性橫紋肌樣瘤的治療方法都將EZH2作為靶點。然而儘管多個研究表明EZH2在三陰性乳腺癌細胞中也存在過度表達，且其含量與腫瘤體積、癌症分期、癌症預後密切相關，但從未有人將其作為三陰性乳腺癌的靶點進行研究。這可能與各種EZH2抑製劑對三陰性乳腺癌細胞均無效有關。

　　金堅教授課題組的研究表明，將EZH2作為三陰性乳腺癌的治療靶點是完全可行的，但是通過抑制其催化活性不能達到抑制癌細胞增殖的目的；將其降解則可以有效抑制腫瘤生長。這為攻克一系列包括三陰性乳腺癌在內的EZH2高表達癌症的治療難題提供了一個新的思路。

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