低光毒探針「點亮」線粒體
來源：中國科學報
作者：倪偉波 唐琳
近日，《化學科學》以在線形式發表的一項研究成果顯示，來自北京大學和西湖大學的研究人員合作研發出兩款新型探針——PK Mito Red（PKMR）和 PK Mito Deep Red（PKMDR），首次在活細胞水平上實現了光毒性的明顯降低。
21世紀被認為是生命科學的時代。科學家為了進一步揭開細胞生物學過程的神秘面紗，研發了各種各樣的生物成像技術。其中，熒光超解析度成像因簡單的成像條件及對生物樣品的相容性脫穎而出。
不過，熒光超解析度成像往往需要更多的光子，因為活細胞超解析度成像需要熒光探針在漂白之前發出更多光子。科學家除了聚焦在如何改善熒光探針光穩定性，更關注漂白過程產生的光毒性。
北大團隊利用新發明的低光毒性PKM系列探針處理細胞，在自主研發的Hessian-SIM儀器上進行線粒體成像實驗。北京大學分子醫學研究所供圖
突破超分辨成像「卡脖子」問題
早在2018年，北京大學分子醫學研究所陳良怡團隊研發的海森結構光顯微鏡（Hessian SIM），首次揭示了活細胞中線粒體的精細內嵴結構及其動態變化。
為了滿足新型光學顯微鏡的需求，國內外諸多科研團隊發展了多種光穩定性的新型線粒體探針，用於觀察線粒體內嵴結構。
然而，超解析度成像需要的高激發光強往往使線粒體熒光探針更易產生活性氧物種（ROS），且不隨採樣時間的間隔增加而消失。
這樣的超解析度成像，即便熒光探針本身並未被完全漂白，也將迅速破壞線粒體內嵴，使線粒體腫脹、變圓。
「光毒性雖然對光學解析度沒有影響，但是會對細胞結構產生極大影響，細胞會受傷害甚至死亡，這種情況下看到的東西與生理反應完全不同。」
此項工作的通訊作者之一、北京大學分子醫學研究所研究員陳知行告訴《中國科學報》。
換句話說，活細胞超解析度成像需要解決的主要問題實際上是改善光毒性，而不僅僅是光漂白。
針對這一領域的新痛點，陳知行團隊利用分子內綴合環辛四烯的策略，成功合成了兩種新型低光毒性線粒體熒光探針——PKMR和PKMDR，首次在活細胞水平上實現了光毒性的明顯降低。
不僅如此，陳知行團隊通過與陳良怡團隊、西湖大學雷凱團隊合作，通過更進一步的實驗，證明新染料對細胞的光毒性顯著低於MitoTracker系列商業染料，可實現1000幀以上、線粒體內嵴形狀基本不變的超分辨成像；首次證明該探針可以用於渦蟲的幹細胞流式分選，且不影響幹細胞的多能性，可以真正用於研究如幹細胞重編程等生理過程中的線粒體功能。
低光毒 更溫柔
陳知行介紹，熒光探針的光毒性一般來自於激發過程中由第一激發單重態（S1）經過系間竄躍產生的第一激發三重態（T1），T1態與氧氣作用可產生單線態氧等活性氧物種，進而破壞生物分子。
為了最大程度抑制這一過程從而減少光毒性，團隊採用了之前應用於染料激光、單分子成像等領域減少光漂白的分子內綴合三線態淬滅劑（自修復染料 Self-Healing Dye）的策略。
HeLa細胞的光照存活實驗發現，常見三線態淬滅基團中只有環辛四烯（COT）能有效降低熒光成像中的光毒性。
更為重要的是，團隊還觀察到，能夠降低光漂白的基團（硝基苯）並不一定能減少光毒性。
正因為如此，「熒光探針的光毒性和光漂白性質應該被分別測試，但以往的熒光探針設計中往往忽視了對探針光毒性等性質的詳細表徵」。陳知行解釋道。
在此基礎上，團隊以COT作為三線態淬滅基團，合成了兩種以Cyanine為母核的熒光探針PKMR和PKMDR。
HeLa細胞的光照存活實驗表明，新探針的光毒性不及對應光譜的商業探針（MitoTrackers）的1/5，並能在相同條件下提供同樣甚至更高的亮度。
「可以說，此項工作為該領域找到了新方向，未來希望能將探針的光毒性降到更低，甚至徹底消除。」陳知行表示。
協同創新 邁向極致
2018年6月，回國後的陳知行加入到北京大學分子醫學研究所。
彼時，陳良怡團隊研發的Hessian SIM不僅將光學顯微鏡的性能提升到一個全新的高度，還從數學和物理兩方面大大改善了超分辨成像技術的光毒性。
要將超分辨成像技術做到極致，必須從化學探針方向進行協同創新。
而化學研究出身的陳知行的加入，無疑為團隊注入了一股強勁的動力。
從2018年6月開始進行探針研究，到如今取得重要突破，團隊只用了1年多的時間，卻迭代了3代設計，最終找到了有效方案。
長期從事渦蟲幹細胞再生研究的雷凱團隊在測試了新探針在渦蟲幹細胞分選領域的應用後，發現新探針標記線粒體可以幫助分選出幹細胞群，而且新探針標記的幹細胞在體外仍能維持較好的活性和乾性，充分展示了其在流式熒光分析分選中優秀的生物相容性。
更難能可貴的是，新探針在長時程超分辨成像方面也顯示出卓越的優勢。
Hessian SIM成像結果顯示，新探針在提供了接近2D Hessian SIM理論值的解析度、展示了清晰線粒體嵴結構圖像的同時，最大程度保留了線粒體健康的原始形態。
而使用商業染料MitoTracker Red CMXRos （MTR）標記的線粒體在140幀左右就發生了腫脹和明顯形變，200幀以上已不可見嵴等正常生理結構，而PKMR標記的線粒體可以提供1000幀以上的健康線粒體圖像，2000幀左右線粒體的形變程度仍小於商業探針的200幀。
「下一步，我們將繼續在數學、物理、化學三方面協同推進，把技術推到極致。同時，爭取將來發力轉化，打破外國公司在高端成像儀器/探針方向的壟斷，真正實現為生物醫學研究者提供超越國外產品的國產高端成像工具。」陳知行表示。
