西湖大學謝琦團隊等利用CRISPR篩選，改進CAR-T細胞治療膠質母細胞瘤的效果
膠質母細胞瘤（GBM）是致死性最高的惡性腫瘤之一，目前沒有有效的治療方法，嚴重威脅人類的健康。患者目前的中位生存期僅為18個月，平均五年生存率低於5％。
CAR-T細胞療法是一種新型的精準靶向腫瘤的免疫療法。從腫瘤患者外周血分離T細胞，通過基因工程技術將針對腫瘤細胞表面抗原的CAR（腫瘤嵌合抗原受體）導入T細胞表達並回輸患者體內，CAR-T細胞通過能夠特異性識別腫瘤細胞的抗原並通過免疫作用釋放大量的多種效應因子，高效地殺滅腫瘤細胞。
CAR-T細胞治療已經在血液腫瘤中取得了巨大成功，但是在實體腫瘤中進展相對緩慢。在膠質母細胞瘤患者中，CAR-T細胞療法已顯示出臨床可行性和安全性的早期證據， 然而其總體結果仍然不能令人滿意，促使人們努力尋求提高靶向膠質母細胞瘤的CAR-T細胞的抗腫瘤效力的新方法和新策略。
近日，西湖大學生命科學學院謝琦研究員、希望之城國家醫學中心Christine Brown教授、加州大學聖地亞哥分校Jeremy Rich教授作為共同通訊作者，在Cancer Discovery雜誌上發表了題為：CRISPR Screening of CAR T Cells and Cancer Stem Cells Reveals Critical Dependencies for Cell-Based Therapies?的研究論文。
該項研究利用基於CRISPR 基因編輯系統的全基因組功能缺失性文庫分別對於CAR-T細胞和膠質瘤幹細胞（GBM中惡性程度最高的細胞群）進行高通量無偏向的篩選，發現了多個能顯著提高靶向膠質母細胞瘤的CAR-T細胞抗腫瘤效力的新靶點。
為最大化地實現該項研究的臨床價值，作者選用了靶向膠質母細胞瘤表面蛋白IL13Rα2的CAR-T細胞，該治療方法已在希望之城醫學中心主持的多項臨床研究中應用於複發腦腫瘤病人，並且已在一位病人中實現多發腫瘤灶的完全緩解（Brown et al, N Eng J Med, 2016）。
在CAR的基礎上進一步對人類T細胞進行基因編輯一直是免疫治療的難點之一，在第一部分針對CAR-T細胞的篩選實驗中，作者分別使用慢病毒和電轉的方法導入SgRNA文庫和Cas9蛋白，從而實現了在CAR T細胞中同時引入功能缺失性文庫的目的。
這些細胞在體外和過量的膠質母細胞瘤患者來源的高表達IL13Rα2的膠質瘤幹細胞共培養，然後通過流式細胞儀富集PD1（PD1?是?T細胞耗竭的一個重要Marker）陽性和陰性的CAR-T細胞進行建庫測序。研究者在兩個不同T細胞供體構建的CAR-T細胞中發現了220個共同基因可以調控CAR-T細胞抗腫瘤活性（圖1）。?這些基因中有一部分是已知的參與T細胞活化或T細胞衰竭的調控分子，也從一個側面驗證了該篩選的可靠性。
圖1:在CAR-T細胞中進行CRISPR 全基因組篩選
作者接著挑選了4個排名靠前且在CAR-T細胞中功能未知的基因（TLE4,IKZF2,EIF5A,TMEM184B）進行驗證。體外實驗顯示在CAR-T細胞中敲除這些基因都可以顯著增加CAR-T細胞對腫瘤的殺傷，增加CAR-T細胞增殖並且抑制CAR-T細胞耗竭（圖2）。
圖2:敲除TLE4等基因增加體外CAR-T細胞的抗腫瘤效應
作者還進一步利用RNA 測序探索了這些基因的分子作用機制。在TLE4或IKZF2 敲除CAR T細胞中，T細胞活化信號傳導相關通路的重要分子（TCR信號，T細胞活化，AP-1和ZAP）被激活，使得其從耗竭狀態中解脫出來，?維持其對腫瘤的殺傷功能。TMEM184B或EIF5A 敲除也誘導了類似T細胞活化信號通路的激活，但是和TLE4或IKZF2敲除不同的是，敲除TMEM184B或EIF5A不會上調細胞因子分泌和應答信號通路。
作者進一步通過單細胞測序發現，和對照組相比，TLE4敲除的CAR-T細胞具有更多分泌大量細胞毒性因子的細胞亞群而IKZF2敲除則降低了Treg細胞亞群的比例並且上調了IFNG、CCL3等激活T細胞因子的表達。令人欣喜的是，針對GBM PDX小鼠模型的體內實驗顯示，和對照組相比，敲除TLE4或IKZF2的CAR-T顯著增強對腫瘤的殺傷，能夠長時間抑制腫瘤的形成，延長小鼠的生存期（圖3）。
圖3:敲除TLE4或IKZF2的CAR-T細胞顯著提高對於小鼠GBM模型的治療效果
在第二部分篩選實驗中，作者利用類似的CRISPR 篩選策略在腫瘤幹細胞中進行了篩選，發現了RelA、NPLOC4等多個顯著調控GSC對CAR-T細胞殺傷敏感性等新靶點，並在體外和體內模型中驗證了其功能。對其作用機制的探索顯示這些基因可能參與了抑制腫瘤細胞分泌炎性細胞因子的作用。
總結一下，該項研究首次在CAR-T細胞和其靶向的膠質瘤幹細胞中實現了CRISPR功能全基因組篩選，發現並鑒定了一系列可調節CAR-T細胞抗腫瘤潛能的基因，提供了通過基因編輯分子靶向技術增強CAR-T細胞的抗腫瘤功效的新策略。該項研究建立的高通量篩選平台可以推廣到不同靶點的CAR-T細胞以及其他過繼性細胞轉移療法中，用以獲得具有臨床收益潛力的可靠靶標。
博士後/科研助理招聘
謝琦實驗室致力於研究腦腫瘤幹細胞的調控機制以及腦腫瘤的免疫治療，現因課題需要，招聘1-2名具有CAR-T研究背景的博士後或科研助理。
https://cancerdiscovery.aacrjournals.org/content/early/2020/12/16/2159-8290.CD-20-1243.full-text.pdf
