NBT｜你沒聽錯，利用細菌抗癌——大腸桿菌用於降解c-MYC
轉錄因子c-MYC?(MYC)?在細胞的生長、代謝、組織發育以及惡性轉化中均發揮著極為重要的作用，具有非常重要的生理和病理功能【1】。已知c-MYC與慢性細菌感染引發的腫瘤惡性轉化和預後生存有關。雖然c-MYC調控著約15%的人類基因並在惡性轉化中發揮著極為重要的作用，但是以往的大量研究卻未能夠找到特異性直接靶向c-MYC的有效分子，也因此c-MYC被認為是一個無成藥性靶點（undruggable target）。由此，研究人員們轉向了靶向c-MYC介導的轉錄機器，比如MAX, ?CDKs, BRD4, USPs等等，但效果有限【2】。
2021年2月11日，瑞典隆德大學Catharina Svanborg課題組在Nature Biotechnology上發表題為A bacterial protease depletes c-MYC and increases survival in mouse models of bladder and colon cancer的研究文章，研究發現了尿路致病性大腸桿菌(Uropathogenic E.coli, UPEC)能夠直接降解和間接抑制人細胞和小鼠組織中的c-MYC並延長小鼠膀胱癌和結腸癌模型的存活時間。
已知MYC在腎的生長和發育過程中起到了重要的作用【3】，而人幼年時期如果有嚴重的細菌感染則會影響腎臟的生長，提示著腎c-MYC水平可能會受到細菌感染的影響。為了研究細菌感染是否會影響宿主的c-MYC水平，研究人員在兒童泌尿道感染?(febrile urinary tract infection, UTI)?急性腎盂腎炎?(acute phelonephritis, APN)?和治療後6個月的外周血樣品中檢測了MYC的mRNA表達水平。結果顯示MYC的mRNA 水平在感染時顯著降低，基因富集分析?(GSEA)?也顯示了MYC相關的靶基因受明顯下調。為了在實驗水平上證明細菌感染是否會影響MYC的水平，研究人員將尿路致病性大腸桿菌UPEC處理人腎上皮細胞，檢測發現尿路致病性大腸桿菌E.coli CFT073 和536菌株都能夠快速降低c-MYC的蛋白水平，而無癥狀性菌尿大腸桿菌E.coli 83972菌株則不能影響c-MYC的水平，提示著細菌抑制c-MYC水平與病毒性有關。研究人員利用細菌上清與腎細胞的培養然後檢測c-MYC的蛋白水平進一步證明了上述結果。以上的結果表明了c-MYC水平能夠在UPEC感染過程中受到抑制。
其次，為了探究c-MYC受到細菌抑制的機制，研究人員選用了病毒性基因和毒力島（pathogenicity island, PAIs）已經被鑒定清楚的UPEC E.coli 536菌株（圖1.a）進行進一步研究。研究人員對E.coli 536菌株進行了PAIs特異性刪減突變，並以此來進行功能缺失篩選實驗。篩選結果顯示，野生型E.coli 536能夠在4小時內顯著抑制MYC的蛋白水平，而缺失PAI I的E.coli 536不能影響MYC的蛋白水平，缺失PAI II毒力島有部分影響，提示著毒力島PAI I在調節MYC水平中起到了關鍵作用、毒力島PAI II 有部分調節作用。研究人員對PAI I和PAI II的各個病毒性基因進行了缺失性突變，發現Hly I 和Hly II對c-MYC的水平有部分影響，提示著Hly的作用及其他序列對MYC水平的影響。進一步地，研究人員對PAI I進行了序列分段缺失突變，最後發現了PAI I中一段編碼細菌ABC轉運蛋白（ATP-binding cassette transporter）的序列起到了調節c-MYC水平的重要作用。通過添加不同金屬離子發現此ABC轉運蛋白介導Zn2 轉運，並影響細菌中調節c-MYC水平的效應分子的表達和釋放。
圖1. a. E.coli 536染色體示意圖；b. 細菌UPEC調節MYC水平的機制示意圖
接著，研究人員考慮到c-MYC表達水平受到細菌的抑制作用是一個非常快速的過程，而c-MYC蛋白本身的半衰期是30分鐘左右，因此他們推測細菌的效應分子可能參與到了c-MYC蛋白的降解過程。研究人員將細菌分泌的上清進行了質譜檢測。質譜鑒定結果顯示Lon蛋白酶（Lon protease）在細菌上清中大量富集，提示著Lon蛋白酶可能參與了c-MYC的直接降解途徑。體外實驗結果顯示了重組Lon蛋白酶（rLon）與c-MYC蛋白反應後能夠降解c-MYC蛋白，而進一步的質譜顯示c-MYC的DNA結合結構域、絲氨酸富集區域和MAX結合結構域被降解了。共聚焦顯微鏡結果也顯示rLon能夠被人腎臟細胞吸收並降低c-MYC的水平。而缺失Hly和缺失Lon的E.coli 536則對c-MYC的抑制作用明顯降低。除了直接的降解過程之外，研究人員還探討了是否存在間接的降解過程。已知酪蛋白激酶I亞型α（CK1α1）能夠磷酸化c-MYC的252位絲氨酸位點，研究人員檢測發現E.coli 536細菌處理過的人腎臟細胞內CK1α1表達水平和活性都上升了，並且證明了Hly對於CK1α1的激活作用和對CK1α1依賴的c-MYC降解作用途徑。
此外，研究人員進一步研究了UPEC能否影響轉錄調控因子從而調節c-MYC的mRNA表達水平。c-MYB是一個轉錄增強子，能夠促進c-MYC的轉錄表達。而CCAAT 增強子結合蛋白delta CEBPD能夠通過與E2F1/RB複合體結合抑制DNA的結合，從而抑制包括c-MYC在內的基因的表達。通過轉錄組數據分析發現E.coli 536能夠調控MYB的靶基因。進一步地分析發現MYB本身的mRNA水平並不受細菌的調控，但其蛋白由Hly介導的蛋白質降解調控。另一方面，他們發現CEBPD在轉錄水平上就受到了細菌的調控，但具體被調控的機制與Lon或者Hly介導的降解方式無關。通過對臨床APN樣品的分析發現：MYB的表達水平在APN中是顯著下降的而CEBPD則顯著上升，提示著細菌能夠通過影響轉錄調控因子c-MYB和CEBPD從而調控c-MYC的轉錄表達。至此，研究人員通過多種方法和不同角度進行了研究，揭示了細菌抑制c-MYC表達的三種機制（圖1.b）。
最後，研究人員探討了細菌產生的效應分子和重組rLon蛋白酶在腫瘤治療中的效果和應用前景。研究人員首先利用細菌產生的效應分子即細菌上清，對多種腫瘤細胞進行了處理，實驗結果顯示細菌上清能夠抑制多種腫瘤細胞中c-MYC的水平，而作為對照組的PAI I、Hly或者Lon 缺失突變的細菌上清不能夠顯著抑制c-MYC的水平。這些結果進一步證明了Lon蛋白酶和Hly蛋白在細菌抑制c-MYC水平過程中的重要作用。接著，研究人員使用rLon蛋白酶對小鼠腫瘤模型的治療效果進行了評估。研究人員選取了小鼠膀胱癌模型和結腸癌模型，用rLon蛋白酶分別對這兩個腫瘤模型小鼠進行了治療觀察。通過對小鼠腫瘤的觀察，他們發現rLon蛋白酶能夠顯著抑制腫瘤的大小以及延長小鼠的生存時間。實驗組小鼠的腫瘤中c-MYC表達水平顯著低於對照組，表明了rLon蛋白酶能夠有效降解小鼠腫瘤中c-MYC的水平並延長小鼠的存活時間。為了進一步說明rLon蛋白酶在臨床方面的應用可行性，研究團隊還分別採用了三種不同的方法檢測了rLon蛋白酶的安全性，即1. rLon蛋白酶對人腎臟細胞的細胞活性沒用毒性作用；2. rLon蛋白酶對健康C57BL/6小鼠沒用毒性作用且小鼠組織中Myc水平不受明顯影響；3. 轉錄組數據顯示rLon蛋白酶處理的小鼠腫瘤模型中被調控的基因絕大部分是腫瘤相關的基因。這些結果證明了rLon蛋白酶的安全性及可應用性。
總的來說，該研究論文發現了重要的轉錄因子和癌基因c-MYC是細菌的一個靶點，UPEC感染一方面能夠促進c-MYC蛋白的降解，另一方面能夠抑制c-MYC的轉錄表達，從而抑制了c-MYC的水平。與此同時，本文的作者將細菌蛋白酶rLon運用到了癌症治療上，證明了rLon蛋白酶在小鼠腫瘤模型中的有效性和安全性，為今後研究細菌在c-MYC異常表達腫瘤以及其他腫瘤的治療上提供了新策略和新思路。
參考文獻
1.Dang, C.V., MYC on the path to cancer.Cell, 2012. 149(1): p. 22-35.
2.Chen, H., H. Liu, and G. Qing, Targeting oncogenic Myc as a strategy for cancer treatment.Signal Transduct Target Ther, 2018. 3: p. 5.
3.Mugrauer, G. and P. Ekblom, Contrasting expression patterns of three members of the myc family of protooncogenes in the developing and adult mouse kidney.J Cell Biol, 1991. 112(1): p. 13-25.
