免疫實驗總不出結果 看看是不是抗體選錯了？

科研試驗涉及到免疫分析的都需要用到>，那麼免疫學實驗都分哪些類型呢，這些不同類型的實驗對抗體有什麼不同的要求呢？

p53抗體有很多種，有單抗有多抗，有小鼠來源還有兔來源的，並且每種抗體能做的實驗還都不一樣，那麼為什麼不同的抗體能做的實驗不一樣呢？這要從抗體是如何製備的開始。

1. 什麼是高質量的抗原？

製備抗體之前最重要的是如何製備抗原。一個高質量的抗原應該具備的標準：

a. 分子量足夠大。我們知道抗原與抗原之間的區別是由抗原決定簇決定的，抗原決定簇又叫做表位（epitope），這些表位通常是由6-8個氨基酸組成的。而且要5-10kD才有一個表位，所以一些分子量太小的蛋白質或者多肽很難有一個表位的，也很難作為一個高品質的抗原。注意表位有兩種形式，一種是線性表位，即由氨基酸的序列決定的。另外一種是構象表位，是由氨基酸的空間結構決定的。兩個相隔很遠的氨基酸序列在空間結構上靠在一起可以形成一個結構表位。

b. 外源性強。抗原必須要與宿主體內的成分區別性大，因為宿主對自身的物質形成了免疫耐受，如果抗原與宿主自身的物質非常相似，則很難達到強烈的免疫應答效果，也很難獲得高質量的抗體。

c. 結構複雜。

2. 製備抗體中常用獲得抗原的方式有哪些？

a. 人工合成多肽。很多家族蛋白相似度很高，比如actin家族中 a-actin, b-actin, r-actin三者之間非常相似，基本上只差幾個氨基酸，而這些差別的氨基酸往往還被包裹在內部。因此只有人工合成這些差別的序列多肽，才可能區分開這三種相似的蛋白質。製備出來的抗體大部分是識別線性結構的蛋白質。

b. 純化的重組蛋白。重組蛋白比較容易獲得，而且能夠獲得比較高的純度。但是在重組蛋白中我們為了純化往往要加入一段標籤（比如GST， His, Flag等），拿這些帶有標籤的重組蛋白去免疫動物，自然也會得到對標籤識別的抗體。我們常常用His作為標籤，因為它比較小，而且免疫原性比較弱，產生的抗體可以忽略。製備的抗體可以識別線性結構的蛋白質，也可以識別天然摺疊狀態下的蛋白質。

c. 純化的天然蛋白。天然蛋白存在修飾，結構複雜，因此是用來做抗體最好的抗原。但很難獲得一定量的較高純度的天然蛋白。製備的抗體最理想的是既能識別天然狀態下的蛋白質，又能識別其線性結構。

3. 不同實驗對抗體有什麼不同的要求？

常規的免疫學實驗包括：WB、IP、CHIP、IF/ICC、IHC、FC，ELISA，在理解上面技術對抗體需求的區別之前我們首先要知道這些實驗技術都需要什麼樣的抗體。

a. WB. WB的蛋白經過加熱變性之後都變成線性的結構。因此最好的抗體是採用非常特異序列的人工合成多肽的方法來做實驗，結果也非常特異。

b. IP/CHIP.我們用抗體去結合生理狀態下的蛋白質，因此IP的抗體最好使用純化的天然蛋白製作的抗體來做，也可以用純化的重組蛋白的抗體。最好不要用人工合成多肽製作的抗體，因為這種抗體識別的位點可能被深深地藏在了蛋白的內心深處。CHIP和IP沒有太大的區別，唯一的問題在於，如果抗體識別的表位和該蛋白質與DNA結合的部位一致，則會導致CHIP實驗的失敗。

c. IF/ICC/IHC. 免疫熒光和>中需要進行固定一步，固定是為了盡量讓細胞的形態結構維持和原有的一致。這種化學物質的固定使蛋白質變性凝固，與天然狀態下的蛋白質有了一定的區別，但是又不同WB中加熱變性變成了線性的結構。因此在做IF/IHC實驗中，最合適的抗體可以是純化的重組蛋白得到的抗體，也可以是人工合成多肽得到的抗體（多肽是在蛋白質的表面）

d. FC 流式細胞中分為兩種，一種是活細胞的流式，這種流式最好採用是天然蛋白或者重組蛋白的抗體來做，另外一種是經過固定之後的流式，和IF/IHC 所用抗體一致。在做流式細胞中，我們有直接標記和間接標記，間接標記不如直接標記真實準確。因此我們選擇流式抗體要採用帶有熒游標記的抗體；如果研究的蛋白沒有直接標記的抗體，那麼就採用間接標記抗體，需要添加熒光>。

e. ELISA 酶聯免疫吸附實驗基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體(聚苯乙烯微量反應板) 表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行。所以根據檢測的目標蛋白的不同也可分為兩種抗體。

4、抗體的選擇：

（1） 如何選擇合適的>？

請先確定您檢測樣品的種屬，然後查找相關產品，根據說明書上描述的「適用種屬和實驗方法」來確定合適的抗體。如果說明書中有明確您要檢測的種屬和實驗方法均經過檢測，則您可以放心地購買該產品。如果說明書中沒有註明您用的種屬和實驗方法經過驗證，則要參考下面的信息：

a、抗體是否能用於其他種屬/實驗方法？

關於某個抗體所有經過檢測的種屬和用途都標明在說明書上，並且會根據最新驗證情況及時得到更新。

b、如何確定某個抗體是否能用於未經驗證的種屬？

抗體公司不能保證某個抗體能夠成功的用於未經驗證的種屬，即使其序列同源性很高。因為一個抗體能否用於檢測其他種屬的影響因素非常多。如果沒有其他的選擇，您需要考慮購買抗體用於未經檢測的種屬時，推薦您先確定下該抗體所用免疫原與您要檢測蛋白的序列同源性。如果相同性超過85％，則該抗體能成功檢測您要測蛋白的可能性會比較高；但是，即使序列相同性超過85％，我們也不能保證該抗體一定能成功用於您的實驗。

c、抗體能否與該蛋白的其它亞型或同一家族其他蛋白交叉反應？

對於一些抗體，說明書中明確指出了與其他蛋白的交叉反應。如果說明書中沒有相關信息的話，我們推薦您比較該抗體的免疫原序列和其他您希望了解的蛋白序列。如果相同性超過85％，則該抗體與比較蛋白交叉反應的可能性會比較高；如果要確定沒有交叉反應，則比較出來的同源性要非常低才行。

d、如何保存抗體?

我們堅持推薦您按照說明書上的推薦的儲存方式來保存抗體。如果您沒有按照要求來保存抗體，那麼很難保證抗體的效果。

e、如何分裝抗體?

請根據一次實驗的用量來分裝抗體，但是每份不應該少於10ul。分裝的體積越小，抗體濃度受蒸發和管壁吸附的影響越大。

（2）如何選擇合適的二抗？

二抗廣義上是指專門和一抗進行特異性反應和結合的抗體，在免疫學反應中，經常需要針對試驗選擇不同的二抗。檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，同時在後繼試驗中也會有不同的檢測方案，因此在選擇二抗的時候要綜合考慮一抗的類型及後繼檢測方案的要求，一般來說，選擇合適的二抗需要從下面幾個方面考慮：

a、 一抗的種屬來源

二抗應選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔>里製備的兔源>，則相應的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據一抗的物種來源選擇相應的抗該物種的二抗。

b、一抗的類別亞型

二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應的二抗就是抗IgG抗體。其中單克隆抗體的類別及亞類通常會在產品說明書中都會有描述，如果你的一抗是小鼠IgM，那麼相應的二抗就應當是抗小鼠IgM。如果單克隆一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那麼幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結合，或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那麼你可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標記實驗中尤其適合。在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下，可以選用抗相應物種IgG。

c、二抗的種屬來源

一般來說，不同的種屬來源與二抗的質量沒有必然的聯繫，來源於山羊的二抗與來源於驢的二抗在一般的實驗里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實驗里， 如雙標實驗里，如果其中一個一抗是山羊來源的，一個是小鼠來源的，則相應的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。

d、二抗的耦聯標記

一般來講，耦聯到二抗上的探針主要有酶（辣根過氧化酶HRP和鹼性磷酸酶AP或其衍生物APAAP，PAP），熒光基團（FITC、 Rhodamine、Texas Red、PE、Rhodamine、Dylight等）、生物素、金顆粒。選用哪種探針的二抗主要取決於具體的實驗。對於Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶標二抗；而細胞或組織標記實驗（細胞免疫化學，組織免疫化學，流式細胞術）中通常使用熒光基團標記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或鹼性磷酸酶標記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用Biotin/Avidin檢測系統。在一些熒光檢測方案中，則需要選擇不同的熒游標記；而金顆粒標記的二抗則更多的應用於免疫電鏡中。

e、是否經過血清吸附過的二抗

為減少二抗與樣本的非特異性結合，可選擇不同血清吸附的二抗。如您的檢測樣本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗就需要選擇抗小鼠源的二抗，如果您對實驗的特異性要求很高，那我們向您推薦經過人血清吸附過的抗小鼠源的二抗，這種二抗由於經過人血清吸附而排除了與人源組織（如IgG等）可能發生非特異性反應的IgG，因此將非特異性結合降低到最低。

f、Anti-IgG還是Anti-IgG, F(ab』)2 fragment

在一些如胸腺、脾臟、血液的組織以及造血細胞、淋巴細胞、B細胞等細胞內，通常含有較多的Fc受體，這時候選擇二抗時最好選擇Anti-IgG, F(ab』)2 fragment這樣的特異性二抗，這樣就消除了由於Fc部分與IgG的非特異性結合。常規的Anti-IgG (H+L)二抗與IgG的重鏈和輕鏈都有結合反應，即與IgG的Fc的F(ab』)2片段都能結合；由於IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結構域，因此Anti-IgG (H+L)與它們都有交叉反應。而Anti-IgG, F(ab』)2 fragment經過了IgG Fc片段的吸附，因此只與IgG的F(ab』)2片段結合，然而IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結構域，因此與它們也有交叉反應。

g、Anti-IgG(H+L)、Anti-IgG (gamma)、Anti-IgM (mu)、Anti-IgA (alpha)

在一些特殊的實驗里，只需要檢測樣本里的IgG或者IgM，常規的Anti-IgG (H+L)由於與IgG的重鏈和輕鏈都有結合反應，而IgG、IgM、IgA都有保守的輕鏈結構域，因此不能特異性的檢測某種類型的IgG或者IgM。這時候就需要針對特殊類型Ig分子的二抗。

5、 常見的問題

a. 做流式的抗體和免疫組化的抗體是一樣的嗎？

不一定能通用。流式是用直接標記還是間接標記？如果是直接標記的話，那這個抗體一般不是FITC標記或者就是TRITC，PE之類的。如果恰好你的免疫組化，也是想用熒光素標記的抗體來直接標記，那就可以通用。如果你的免疫組化要用其它的標記的話，或者是間接標記的話，就有麻煩，因為熒光素的標記很可能會影響二抗和一抗的結合。

b. 為什麼我的抗體做WB非常好，而做不了IF，IHC等其他任何實驗？

首先恭喜你有一個WB非常好的抗體，畢竟能獲得做WB非常好的抗體也不容易。其次，你這個抗體很可能是通過人工合成多肽得到的，和上面所述，你用來做抗原的多肽恰好被包埋在蛋白質的中心，因此只能識別WB中線性的部分。

c. 如何選擇免疫組化抗體？

首先，一抗是選擇單克隆抗體還是多克隆抗體，單克隆抗體特異性強，靈敏度低；多克隆抗體靈敏度高，特異性弱。根據你的實驗結果，如果非特異多，那麼選擇單克隆抗體；如果陽性信號弱，不妨選擇多克隆抗體試試。一般家兔來源的都是多克隆，小鼠來源的是單克隆。其次是要弄明白該一抗能夠識別什麼種屬的抗原，抗體說明書上面一般註明有，比如小鼠Mus, 大鼠Rat, 人Hum。再次比較重要的是要注意一抗的來源。比如我們在人的癌組織中做p53的免疫組化，一抗我們採用的是小鼠來源的p53抗體，那麼二抗我們一定要選擇 抗小鼠的二抗比如（山羊抗小鼠，兔抗小鼠），這一點非常重要。最後，一般的抗體說明書都會註明能做什麼實驗，如果標明了不可以做免疫組化，一定不要選擇；反過來說，即使標明了可以做免疫組化，也不一定能夠做，商家只會誇大其效果。

d. WB和IF的二抗是一樣的嗎？

很明顯，不是！免疫熒光抗體是用於 免疫熒光試驗的，是用FITC或PE等標記的抗體，結果需要紫外線激發並用熒光顯微鏡觀察WB抗體一般是HRP或鹼性磷酸酶等標記的抗體，需顯色底物（如OPDTMB等）直接顯色（肉眼）或化學發光法顯影（需特殊儀器）。

e. 做CHIP的抗體是否可以用來做WB抗體？

不一定，一般來說做CHIP級別的抗體對抗體純度特異性方面都要求比較高，基本上能做CHIP的抗體都可以做WB。但是如果CHIP的抗體識別的是構象表位（比如是由兩個實際靠在一起但變為線性結構之後相隔很遠的兩端序列），而不是線性表位，這種CHIP抗體做不了WB。

f. 抗體說明書上面沒有寫該抗體能夠用於某項實驗怎麼辦？

一般而言，抗體研發出來之後都要經過WB，IP，IF，IHC實驗。檔發現濃度不夠做IF，IHC時候，國外的抗體一般都是寫未檢測，國內的抗體一般是不寫。所以盡量不要抱著試試的心裡去嘗試，往往只會浪費時間。你想啊，如果抗體能夠做該實驗，他們肯定會寫上去啊。

g. 做ELISA的抗體能否用來做WB？

通常用WB抗體稀釋濃度為1:1000，IF/IHC為1:100，而如果可以做ELISA則可以稀釋1:10000。如果一個抗體用來做ELISA的，那麼言外之意就是該抗體效價不高。但不是說ELISA的抗體不能用於做WB，抗體說明書提示做ELISA稀釋比例為1:1000，那麼你可以試試1:100做做WB。

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