川大賈大組Nat Comm揭示囊泡運輸複合體Retromer的調節機制

2016年11月9日，NATURE COMMUNICATIONS正式發表四川大學華西第二醫院賈大研究組題為「Structural and mechanistic insights into regulation of the retromercoat by TBC1d5」的研究成果。該項研究成果利用生物化學，細胞生物學，結構生物學等手段確定了GAP蛋白 (GTPase激活蛋白)TBC1d5與貨物運輸囊泡的Retromer複合體相互作用的分子機制，闡述了TBC1d5調節retromer貨物運輸的機理，深化囊泡運輸調控機制的認識和理解。

囊泡運輸在膜包被的各種細胞器之間以及細胞器與質膜的物質交換髮揮著重要功能。其中關鍵蛋白分子是衣被蛋白複合物。衣被蛋白複合物主要有兩個作用：識別的被轉運蛋白分子（貨物），將這些貨物募集在一起形成運輸小泡（囊泡）；如同模具一樣塑造運輸小泡的外部特徵。運輸小泡通常從一個細胞器以芽生方式形成，包裹被運輸的貨物，經過轉運後到達新的細胞器並與之融合。從形態觀察，既有球狀運輸小泡，也有管狀運輸小泡（見下圖）。

經典的衣被蛋白複合體，如網格蛋白有被囊泡（Clathin/AP2）, COP I 和COP II,調節球狀運輸小泡的生成；與此不同，新型衣被蛋白複合體Retromer主要調節管狀運輸小泡的運輸。Retromer主要介導貨物蛋白由內體向反式高爾基體或者細胞質膜的運輸。Retromer功能的異常與帕金森等神經退行性疾病以及腫瘤的發生髮展緊密相關，同時還參與機體正常的生長發育過程的調控。

本研究發現TBC1d5通過與Retromer主要組分VPS26/VPS35/VPS29複合物直接結合而且形成穩定的複合物。TBC1d5是Tre2- Bub2-Cdc16 (TBC) 家族成員之一，TBC1d5是該家族中唯一已知與retromer結合的蛋白。該相互作用由TBC1d5的TBC domain（具有GAP活性結構域）和retromer中的VPS35，VPS29兩個蛋白介導（圖2）。其中TBC domain中兩個獨立的片段Insertion 1和Insertion 2 對於相互作用至關重要。生化實驗，晶體結構及小角散射實驗表明Insertion 1和VPS29結合，Insertion2與VPS35結合。VPS35的HEATrepeat 6結構模序對TBC1d5結合很重要。有趣的是，敲除HEAT repeat 6後VPS35將無法定位在內體上。

小G蛋白Rab7酶對於retromer的內體定位非常關鍵。賈大等人研究表明TBC1d5/Retromer能夠直接並且特異性地與Rab7-GTP結合，此外Retromer能夠顯著提高TBC1d5的GAP活性（促進Rab7-GTP水解）。這些數據揭示Retromer和經典的衣被蛋白複合體，比如COPII，儘管形成不同的囊泡結構，但是存在著內在的相似性（圖3）。

為了更深入解析TBC1d5對Retromer的調節功能，研究人員通過CRISPR/Cas9體系構建了TBC1d5基因敲除HeLa細胞，結果顯示TBC1d5敲除並不影響VPS35在胞內體的定位，但是卻引起Retromer經典貨物CI-MPR和CD49a在細胞內的分布，即影響了Retromer的貨物運輸功能(圖4)。本項工作為後期進一步完善Retromer包被囊泡的形成和調控機制奠定基礎，並為設計新型靶向Retromer囊泡運輸藥物提供直接依據。

該研究的共同通訊作者還有西南醫學中心的Mike Rosen和梅奧中心的Daniel Billadeau教授。文章作者包括梅奧中心和溫州醫科大學的張金三，賈大實驗室的李放和王晶等人。

賈大教授是四川大學華西第二醫院和生物治療國家重點實驗室的雙聘教授，國家青年千人計劃入選者。實驗室從事細胞內運輸與相關疾病的機制研究，並針對性地開發小分子藥物。

花絮和評點：這個課題最有意思的是，初期實驗結果顯示retromer會和經典衣被蛋白，比如copII，很相似，用類似的方法組裝和解離，這差不多是是一個CNS級別的發現。但是後來實驗結果表明retromer可能與copII有一定相似性，但也有很大區別。比如說，沒有tbc1d5, retromer仍舊可以在內體上定位。更具體的機制目前也不清楚，所以這項研究最終發表到NC也算正常。

（致謝：感謝川大華西二院賈大教授對文本的貢獻！）

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