探索基因編輯的奧秘

導語：過去幾年，有一部名為《人類簡史：從動物到上帝》的科普著作風靡全球，受到包括臉書創始人扎克伯格、世界首富比爾·蓋茨和美國總統奧巴馬在內的廣大讀者的熱烈追捧。該書作者是以色列學者尤瓦爾·赫拉利，他在書中對人類的未來做了這樣的預言：「時至今日，智人似乎只要再跨一步就能進入神的境界，不僅有望獲得永恆的青春，更擁有創造和毀滅一切的神力。」隨著科技進步，人類的所作所為的確是越來越接近上帝，其中最典型的則非基因組編輯莫屬。毫不誇張地說，隨著技術的提升，用不了多久，人類將可以運用基因組編輯的手段，對人類自身的性狀進行各種選擇，而這之前是只屬於上帝的「工作領域」。

那麼，基因組編輯到底是怎麼回事?其最新進展如何?對人類未來究竟會有怎樣的影響?針對這些問題，一直處於該科學領域研究前沿的北京大學生命科學學院魏文勝教授，曾作了一場通俗易懂，別開生面的科普講座《編輯生命密碼》，很好地詮釋了這些問題。同時，魏文勝教授帶領的課題組一直致力於基因組編輯、感染性疾病等方面的科學研究，已經取得了多項國際領先的豐碩成果，多次在國際頂級期刊發表，受到廣泛關注。

魏文勝生於江蘇，曾先後就讀於新海中學、北京大學，後進入美國斯坦福大學進一步深造。現任北京大學生命科學學院研究員、博士生導師，同時擔任北大生物動態光學成像中心(BIOPIC)研究員，北大-清華生命科學聯合中心(CLS)研究員，北京未來基因診斷高精尖創新中心(ICG)研究員。因科研和教學成果突出，曾獲拜耳學者獎、羅氏中國青年學者獎、中國專利優秀獎、談家楨生命科學創新獎、鄭昌學教學優秀獎、北京大學生命科學學院最受學生歡迎獎等。主要研究領域和方向為真核基因組編輯及高通量功能基因組學，在此基礎上研究癌症、感染等重大疾病發生髮展的分子機制，為發展高效治療手段提供新的藥物靶點和思路。

下面，就讓我們隨著他的研究步伐，一起走進基因組編輯的神秘世界，揭開生命密碼。

(責編：王瑞景)

TALEN和CRISPR，基因組編輯兩大武器

基因組編輯有什麼神奇之處?我們不妨展開一番暢想。未來的人，通過基因組編輯技術，不僅可以從根本上避免致病基因遺傳給後代，解決某些感染性疾病的預防和治療難題，而且可能真的就像上帝造人那樣，隨心所欲地塑造「完美寶寶」。因而基因組編輯技術是一個革命性技術，也是一個革命性機會。目前國際知名的專註於基因組編輯的公司還都處於研發階段，但是多家公司已經在納斯達克上市，說明人們看好它的大好前景。在這股浪潮中，作為國內在該領域走在前列的研究者，魏文勝希望中國也不應缺席。他說：「基因組編輯未來產業運用發展是如今的熱點，利用這一技術，不管做動植物轉化、改造還是應用於醫藥領域，可以做的事情非常多。」

基因組編輯被稱為「上帝的剪刀」，就是對構成生命最基本的遺傳單位——基因直接進行設計和修改，就像用一把分子剪刀對基因序列進行準確的編輯，屬於當今生命科學界最炙手可熱的科學技術。

自從二十世紀中葉，沃森和克里克發現DNA雙螺旋結構，人們就開始探索能夠應用到生物體中的基因操作技術。科學家發現，一種廣泛存在的蛋白結構模塊鋅指(ZF)能夠介導蛋白質與核酸間的相互作用，將這些模塊化的鋅指串聯起來，所形成的蛋白能夠特異性識別並結合DNA，這種蛋白就是鋅指蛋白(ZFP)。研究發現，細胞內不同鋅指蛋白具有可特異性識別DNA上3聯鹼基的特徵，在加上核酸酶FokⅠ二聚化後可以切割DNA的特點，便可以通過鋅指蛋白偶聯FokⅠ的策略，發展出一種基因組編輯技術——鋅指蛋白核酸酶技術(Zinc Finger Nucleases, 簡稱ZFNs)。ZFNs技術目前已經在小鼠、斑馬魚、擬南芥等許多生物中試驗成功，並能產生穩定遺傳的突變，但該技術專利被公司壟斷，且模塊化程度有局限性，其應用受到了很大的限制。

在1989年科學家發現一些致病細菌通過第三類的分泌系統，可以把自己的蛋白跨界傳送到動植物或者人類宿主細胞內。這些蛋白有非常多的重複區域，能夠結合基因組序列影響一批基因的表達。研究人員終於在2009年發現了這類蛋白的作用機制，其中的第12、13個氨基酸是可變的，決定該重複單元對DNA鹼基的特異性識別。由此，科學家發展出了新的基因組編輯技術——轉錄激活樣因子核酸酶技術(Transcription activator-like effector nucleases, 簡稱TALENs)。TALE是一種從植物病原體——黃單胞桿菌中分離出來的蛋白，這種蛋白能夠通過特異性結合宿主DNA，調控其表達來提高病原體的致病性。TALE蛋白與鋅指蛋白最大的不同體現在，TALE蛋白的重複單元與DNA的鹼基是按照一對一的識別方式特異性識別的。這相比使用鋅指蛋白靶向DNA序列更加穩定，特異性也更高且不受序列的限制。此技術理論上可以實現對任意基因序列的編輯，標誌著基因編輯技術開始起飛，但構建編碼TALE蛋白的DNA序列的過程較為繁瑣，一定程度上限制了其應用。

近年來，在細菌和古細菌中發現的規律成簇的間隔短迴文重複序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，即CRISPR)系統逐步發展成為新一代基因組編輯技術——CRISPR技術，使得基因組編輯變得更為簡易、高效。自2013年Science雜誌將CRISPR技術選為年度突破開始，這一新技術就給基因組編輯世界帶來一場風暴。在一年半時間裡，CRISPR方法已迅速席捲了整個生命科學界，成為基因組編輯的明星技術。

CRISPR系統其實是相對低等的原核生物(如細菌和古細菌)中存在的一種獲得性免疫機制。在細菌抵禦噬菌體入侵的過程中，進化出一套機制，能夠使其把噬菌體基因編碼區的片段整合到CRISPR的序列裡面，從而記憶曾經入侵的DNA。當下一次這種噬菌體再度入侵的時候，細菌就能根據這些片段產生一些小RNA來準確識別噬菌體的基因組，然後通過細菌內的特定核酸酶破壞噬菌體的基因組。CRISPR技術是一種利用RNA介導的基因組編輯技術，相比ZFN和TANEN依靠蛋白質與靶基因序列特異性結合，CRISPR只需要通過設計RNA的序列即可，相比前兩者更容易構建，且特異性更高，嚮導序列與作用位點結合得更加穩定。自從研究清楚CRISPR系統的工作原理後，科學家迅速把它應用到基因組編輯的研究中。

構建編碼高重複性的TALE蛋白的DNA序列的分子克隆是該技術應用的難點，使得TALEN的應用門檻更高。單純從針對一個基因的編輯效率、脫靶率這些評價指標來說，其實很難比較出CRISPR和TALEN誰更優秀，甚至有很多研究認為TALE有更低的脫靶率。由於魏文勝課題組很早就開始關注TALEN技術，他們擁有一套獨特的方法，可以快速大量的構建TALE/TALEN。此外，魏文勝課題組率先完成了所有TALE重複片段識別DNA鹼基的全解碼，又進一步獲得能夠特異性識別有表觀遺傳修飾(如甲基化修飾)鹼基的TALE重複模塊。這些新發現和新技術成果，可能對於基因組編輯技術在生物醫學研究以及產業化方面有特殊的應用。

當前基因組編輯的應用與潛力

臨床上經常發現，大量服用抗生素的病人很容易引發腹瀉，這種腹瀉大部分是由一種叫艱難梭菌的細菌感染造成的。在美國疾控中心發布的報告顯示，每年因為艱難梭菌感染造成的醫療花費，超過10億美金。魏文勝團隊之前通過RNAi篩選結合深度測序技術，找到了艱難梭菌致病毒素B的細胞受體CSPG4。但是在這個研究過程中，他們意識到RNAi篩選有非常多的問題，比如假陽性非常高，基於基因表達部分抑制的技術通常會獲得大量的候選基因，且脫靶效應很高，所以他們一直在尋找一個更好的方法。後來，通過利用CRISPR工具高效和易於構建的優勢，他們建立起基於基因敲除的高通量功能性篩選平台，並且用兩種毒素蛋白(炭疽毒素和白喉毒素)對這一新技術平台進行了驗證。魏文勝課題組同樣進行了對於HCV丙型肝炎病毒宿主基因的篩選，發現了三個已知的關鍵因子，這些都是重要的潛在治療靶點，對新葯研發有很重要的意義。

在這個平台基礎上，魏文勝團隊進一步發展了雙gRNA篩選系統，這個系統通過直接在基因組上刪掉大片段的方式，不僅能夠找出編碼基因與疾病之間的關係，也可以用來研究非編碼區域，如長鏈非編碼RNA(lncRNA)。他們已經用這種方法找到一些可以正向或負向調控細胞增殖的lncRNA，這些重要的促癌或者抑癌lncRNA提供了新的治療靶點，研究其在癌症發生髮展過程中的作用具有重要的應用價值。

那麼什麼是實現以上暢想的最關鍵的因素呢? 在魏文勝看來，安全性、系統導入或者說給藥方法、以及效率，是急需解決的問題。安全性是最重要的，目前整個領域都在研究如何控制基因組編輯工具的脫靶效應，在這方面TALE有可能更有優勢。系統導入方法方面，目前傾向於使用病毒工具的依然居多，考慮到病毒載體本身的限制，由於TALE的個頭更大，CRISPR確實有一些優勢。但是如果把基因組編輯與細胞治療相結合，在體外進行編輯，這個問題就會簡單很多。當把基因組編輯的這些工具(比如CRISPR或者TALE)導入到細胞以後，並不是所有細胞都會被編輯，這就涉及基因編輯效率的問題。由此可見，基因組編輯技術還有很大的提高空間，效率提升在醫藥領域裡面顯得至關重要。以下這兩個例子就詮釋了基因組編輯技術應用的巨大潛力：

單基因遺傳病。比如地中海貧血症，這是很典型的疾病，因為它發病的原因就是單個基因的突變。用基因組編輯的方法，把錯誤的地方改過來，就可以治癒疾病。這是目前研究者廣泛關注的研究領域。

感染性疾病。用基因組編輯的方法治療感染性疾病，比如，HIV是威脅巨大的感染性疾病。早在TALE之前，就有公司使用歷史更為悠久的基因組編輯工具ZFN，使用ZFN可以把T細胞上一個HIV侵染的關鍵因子CCR5基因去除，沒有了CCR5的T細胞就不會再被HIV攻擊了。通過這種方式，可以製造出一些對HIV免疫的特殊T細胞，並通過這些T細胞來維持病人一定的免疫能力。目前這個療法，已經做到了II期臨床。

基因組編輯技術不但單獨可以作為一種治療方法，也可以與很多其他的治療方法相結合。比如現在很熱門的免疫治療，CAR-T治療。利用基因組編輯的方法，去除掉T細胞上引起免疫排斥反應相關的基因，就可以實現T細胞的異體移植，這個想法已經由一個法國公司實現了。科學家還可以考慮用基因組編輯的方法，將CAR高效且定點插入T細胞的基因組中，這樣就使得CAR的導入更加可控，擺脫由於慢病毒導致的問題。我們甚至可以考慮直接將T細胞表面的PD-1去除，用來直接對抗癌症。

同時，科學家也面臨著倫理挑戰。使用基因組編輯技術，人們真的可以部分扮演上帝了。那麼這麼做的底線是什麼?在道德上是不是可以接受?技術和倫理會不可避免地出現衝突，但最終需要平衡二者。

豐碩成果，國際領先

2014年在《Nature》發表的一項研究中，魏文勝課題組開發出一種基於CRISPR/Cas9系統的慢病毒聚焦型人源細胞文庫、功能性基因篩選平台以及基於高通量深度測序技術解析數據的完整技術路線。利用這一高效的新型遺傳篩選技術，成功鑒定出對兩種細菌毒素侵染宿主所必需的宿主受體、以及多個相關的宿主基因。在細菌和古細菌中的CRISPR–Cas系統，已經被發展成為一種具有廣泛應用的基因組編輯工具。編碼基因的功能性篩選已被廣泛採用，通過使用細胞生長或特定標記作為一個篩選方法，可以將靶定特定表型相關基因的sgRNAs富集出來。雖然類似的策略被用來研究調控元件，以探討順式元件的功能，但這樣的策略不適用於不依賴於讀碼框非編碼元件。另外，雖然已有兩個gRNAs引入基因組缺失來探討單個lncRNAs的功能，但是使用這種方法的高通量篩選尚未見報道。

次年，魏文勝帶領課題組與華南理工大學、美國馬里蘭大學的研究人員合作，在《Cell Research》發文，首次確定了艱難梭菌關鍵致病毒素TcdB的細胞受體CSPG4，並通過TALEN和CRISPR/Cas9介導的基因組敲除，證實了它在人類細胞中的作用，為艱難梭菌感染的治療提供了一個新的治療靶點。

三月初，魏文勝在國際著名學術期刊《FEBS Journal》發表當今熱門技術CRISPR-Cas9系統應用於高通量功能性篩選的綜述文章，在文章中他概述了CRISPR-Cas9文庫介導的功能性篩選的一般程序、系統優化策略以及這種新遺傳工具的應用。

當月魏文勝課題組還與清華大學、美國阿拉巴馬大學伯明翰醫學院的研究人員合作，在Nature子刊《Scientific Reports》發表題為「A Dual-reporter system for real-time monitoring and high-throughput CRISPR/Cas9 library screening of the hepatitis C virus.」的研究論文。這項研究的研究對象是丙型肝炎病毒(HCV)——慢性肝炎、肝硬化和肝癌的主要原因，感染全球約1.7億人。雖然目前已經開發出幾種報告系統，但是許多缺點限制了它們在HCV感染評估中的應用。鑒於此，魏文勝課題組報道了一種被稱為NIrD的實時活細胞報告系統，能夠特異性響應HCV感染。他們使用NIrD系統和CRISPR/Cas9文庫，確定了CLDN1、OCLN和CD81基因為HCV入侵細胞和細胞間傳播的必需基因。將這種超敏感的報告系統和CRISPR敲除篩選相結合，為確定HCV感染的關鍵宿主組件，提供了一種強有力和高通量的策略。

同年五月份，魏文勝課題組也在細胞自噬國際權威期刊《Autophagy》發表一項重要研究成果，題為「Divergent roles of BECN1 in LC3 lipidation and autophagosomal function」。 BECN1/Beclin 1被認為是III型磷脂醯肌醇3-激酶(PtdIns3K)複合體誘導細胞自噬的一個關鍵組件。儘管其在許多細胞和生理過程中發揮重要的作用，但是BECN1在自噬中的確切作用仍存在爭議。在這項研究中，研究人員用TALEN技術，製備了一個BECN1敲除的人類細胞系。令人驚訝的是，BECN1的完全缺失對LC3 (MAP1LC3B/LC3B)脂質化的影響不大。電子顯微鏡(EM)分析顯示，經氨基酸飢餓處理後，BECN1缺陷可導致包含多層細胞膜的畸形自噬體樣結構。研究人員進一步證實，PtdIns3K複合體活性和自噬潮(autophagy flux)在BECN1-/-細胞中是被破壞的。這些結果表明，BECN1在自噬體的功能性形成中(而不是LC3B脂質化)，發揮至關重要的作用。

如今魏文勝教授又在《Nature Biotechnology》雜誌發表的一項研究中，報道了一種高通量的基因組刪除策略，通過慢病毒介導的配對嚮導RNA(pgRNA)文庫，來篩選功能性的長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)。魏文勝和哈佛大學T.H. Chan公共衛生學院的劉小樂教授是本文共同通訊作者。篩選已被廣泛用於分析編碼基因功能，但是，用這種方法對不依賴讀碼框的非編碼元件的研究具有很大的挑戰性，因此他們開發了基於基因組大片度刪除的篩選方法來研究非編碼因素並進行高通量功能性篩選。應用這種篩選方法，研究人員確定了51條lncRNAs，它們可能正向或負向調節人體癌細胞的生長。他們使用CRISPR/Cas9介導的基因組缺失、外源表達、CRISPR激活或抑制以及基因表達譜，驗證了51個篩選獲得的lncRNA中的9個。這種高通量pgRNA基因組刪除方法，將使科學家們能夠快速識別功能性的哺乳動物非編碼元素，具有非同尋常的意義。

魏文勝實驗室在不斷衝擊科技前沿的同時，也培養出了一批批的優秀科研及產業人才。除了個別學生在國外頂級實驗室繼續深造之外，更多的已經在知名生物科技公司工作並獨立領導科研項目，還有部分進入到政府、公司，也活躍在生物科技的創業、創新事業之中。

當今之世，處於新一輪科技大爆發前夜，人工智慧、納米科技、生物技術等等，每一項取得突破，都將全面改變我們的生產和生活。基因組編輯技術，就是其中的重要一環。如今，魏文勝及其團隊已經在該項研究領域走在了行業的前列，為我國在該領域趕上並領先世界先進水平做出了巨大的貢獻。我們期待他們在這條科研大道上再接再厲，創造更多更大的輝煌。也期望中國科學家能在基因編輯技術發展以及產業化應用方面走在國際前列，造福於人民百姓。

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