中科院生物物理所劉志傑課題組揭示抗病毒天然免疫通路識別新機制

2016年11月1日《PNAS》雜誌在線發表了生物物理所題為「Structural basis for DNA recognition by STAT6」的研究論文，首次揭示STAT6對N4位點DNA的識別機制。

人類的病毒性感染十分普遍，多數為隱性感染而不易被發現，如成人幾乎都感染過單純皰疹病毒；少數則發生顯性感染，可引起突發性或慢性傳染病，如病毒性肝炎、艾滋病，近期在西非發生的埃博拉出血熱等。病毒與宿主在長期進化過程中相互作用引發機體出現了複雜而精細的免疫機制，天然免疫反應就是宿主抵抗病毒感染的第一道屏障。天然免疫如同機體的眼睛，監視與識別各種外來微生物入侵。機體通過啟動免疫反應，引發一系列抗病毒基因表達，最終利用炎症反應來清除感染，了解這一分子基礎是天然免疫研究的重要內容。

2011年，北京大學蔣爭凡教授課題組通過cDNA表達文庫的功能性篩選，發現了通過STING-TBK1可以激活原本在適應性免疫中發揮重要功能的轉錄因子STAT6（signal transducer and activator of transcription 6），揭示其在抗病毒天然免疫通路中也有重要作用。其研究從分子、細胞到動物整體多個層次揭示了轉錄因子STAT6在機體天然免疫和適應性免疫中發揮雙重作用的分子機制，研究結果將為STING介導的宿主天然免疫反應提供新的補充，為人類對病毒感染導致的自身免疫性疾病、多器官慢性炎症的診治和抗禦病原微生物感染的分子機制研究提供新思路。

圖示：STAT6核心片段在全長中所在的區域及STAT6核心片段與N4位點DNA複合物結構。

STING有關的信號通路一直是我們關注的領域，STAT6因與STING有相互作用引起我們的注意。此前報道STAT6作為信號轉導及轉錄激活因子家族中的一員，參與到JAK-STAT信號通路，受到IL-4/IL-13的調控，將信號從細胞膜傳遞到細胞核並激活下游一系列基因的轉錄表達，在Th2細胞的分化過程中起到關鍵作用。STAT6表達與炎症和多種腫瘤關係密切，可能成為新的腫瘤標誌物，檢測STAT6分子具有重要臨床意義，可以作為判斷預後的指標和治療的新靶點，篩選出該通路的抑制分子就可能成為STAT6通路的異常所致疾病的潛在預防和治療的作用藥物。STAT6家族蛋白作為轉錄因子首先在胞質中磷酸化後形成二聚體，二聚體的STAT6進入細胞核並識別和結合靶基因啟動子區域啟動一系列基因表達。STAT家族蛋白識別相似的DNA序列，其基本結構為TTCN3/4GAA，但是不同的STAT蛋白所識別的DNA迴文序列的中間間隔區長度不同。在哺乳動物STAT家族中，STAT6是唯一一個主要識別N4位點啟動子（TTCN4GAA）的家族成員，而其他STAT家族蛋白以識別N3位點啟動子（TTCN3GAA）為主。對於這種對DNA識別差異的結構基礎，至今仍缺乏比較合理的機制闡述，尤其STAT6對N4位點DNA的識別機制是過去10多年一直沒解決的一個重要科學問題。

本研究採用結構生物學方法解析了STAT6核心區的磷酸化二聚體晶體結構，同時完成其與N4位點DNA和N3位點DNA兩個複合物三維精細結構的解析工作，這是其它STAT家族蛋白中從來沒有過的，因此我們有足夠的結構資源進行結構分析。STAT6核心區的磷酸化二聚體結構與其它已解析STAT蛋白結構採用相似機制形成「V」字形。通過結構比對發現，結合核酸以後，STAT6二聚體發生一個明顯的旋轉型的構象變化，同時發現結合N4位點DNA和N3位點DNA後STAT6關鍵氨基酸H415在DNA雙螺旋軸方向的位置變化距離與DNA雙螺旋中相鄰2個鹼基之間的垂直距離（approximately 3.4 ? rise/bp along the axis of a B-DNA double helix）相符。這部分工作是在STAT蛋白家族中首次針對同一STAT蛋白觀察到結合DNA前後的構象變化。分子動力學模擬以及小角散射實驗的結果都證明了STAT6的構象在DNA結合後處於更穩定的狀態。通過與其它已報道STAT蛋白結構比較發現，STAT6磷酸化二聚體中「V」形的夾角比其它STAT蛋白要大一些，導致二聚體結構中的兩個分子之間的動態變化範圍更廣。同時我們發現，STAT6 DNA結合結構域上的H415是唯一與DNA鹼基直接相互作用的氨基酸，這引起我們的關注。序列分析發現除STAT5以外，在其它STAT蛋白上H415所對應的氨基酸是N(Asn)。體外實驗發現，STAT6的H415突變成N後識別N4位點DNA的能力明顯下降而識別N3位點DNA的能力上升，而將STAT1上相應的氨基酸N460突變成H後識別N3位點DNA的能力明顯下降而識別N4位點DNA的能力上升。細胞水平實驗也證明STAT6的H415對STAT6特異性結合N4位點DNA具有關鍵作用。STAT5不能廣泛識別N4位點DNA可能是因為一方面STAT5二聚體夾角稍小，另一方面H471的側鏈伸展方向與STAT6的H415不同。

本研究工作主要由劉志傑課題組博士生李靜和美國UCLA程根宏課題組博後Jose Pindado博士共同完成，歐陽松應研究員為本文通訊作者。課題曾獲得生物物理所趙永芳課題組、中科院藥物所邵強博士團隊、天津醫科大學楊潔課題組以及芬蘭奧盧大學Gong-Hong Wei教授等人的大力幫助。該研究得到國家自然科學基金委、科技部、北京市科委和中科院青促會等基金的資助。

Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Nov 1. pii: 201611228. [Epub ahead of print]Structural basis for DNA recognition by STAT6.

Abstract

STAT6 participates in classical IL-4/IL-13 signaling and stimulator of interferon genes-mediated antiviral innate immune responses. Aberrations in STAT6-mediated signaling are linked to development of asthma and diseases of the immune system. In addition, STAT6 remains constitutively active in multiple types of cancer. Therefore, targeting STAT6 is an attractive proposition for treating related diseases. Although a lot is known about the role of STAT6 in transcriptional regulation, molecular details on how STAT6 recognizes and binds specific segments of DNA to exert its function are not clearly understood. Here, we report the crystal structures of a homodimer of phosphorylated STAT6 core fragment (STAT6CF) alone and bound with the N3 and N4 DNA binding site. Analysis of the structures reveals that STAT6 undergoes a dramatic conformational change on DNA binding, which was further validated by performing molecular dynamics simulation studies and small angle X-ray scattering analysis. Our data show that a larger angle at the intersection where the two protomers of STAT meet and the presence of a unique residue, H415, in the DNA-binding domain play important roles in discrimination of the N4 site DNA from the N3 site by STAT6. H415N mutation of STAT6CF decreased affinity of the protein for the N4 site DNA, but increased its affinity for N3 site DNA, both in vitro and in vivo. Results of our structure-function studies on STAT6 shed light on mechanism of DNA recognition by STATs in general and explain the reasons underlying STAT6 s preference for N4 site DNA over N3.

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來源：中科院生物物理所

本期編輯：Tony

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