獻給初學者：PCR 看這篇就夠了

聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是 80 年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重複性好、易自動化等突出優點。

一

PCR 實驗步驟

PCR 反應試劑

DNA 模板

與特定 DNA 模板結合的引物

去離子水

商業化的 DNA 聚合酶以及緩衝液

dNTP

MgSO4（可選）

DMSO（可選）

PCR 反應準備工作

PCR 反應開始前，你需要準備好 DNA 模板（基因組 DNA 或者反轉錄製備的 cDNA）, 特異性的引物（手動設計或利用軟體設計）並選擇合適的商業化 DNA 聚合酶（根據實驗的目的不同做出決定）。

DNA 聚合酶的選擇

市面上有多種 DNA 聚合酶可供選擇，他們的特性也各有不同。因此你需要選擇最適合自己實驗需要的產品。通常我們將 DNA 聚合酶分為高保真性聚合酶和普通的 Taq 聚合酶。如果你希望得到沒有任何突變的 PCR 產物，那應當選擇高保真聚合酶。若你只是希望判斷特異性序列的存在與否，那普通的 Taq 聚合酶已經足夠。

另外要注意的一點是，進行 T 載體連接的時候，要了解高保真的聚合酶所得的產物是沒有 A 末端的，因此你在 T 載體連接之前需要進行加 A 反應。或者直接選用普通的 Taq 聚合酶。

引物

引物特異性會影響到 PCR 反應成功的可能性，好的引物設計對 PCR 成功至關重要。設計引物時，有以下幾條原則需要謹慎考慮：

引物長度。通常 PCR 引物長度在 18~22 個鹼基之間。這對引物的特異性以及退火溫度而言均已足夠。

解鏈溫度 （Tm）。Tm值的定義是使得一半雙鏈 DNA 解螺旋成為單鏈 DNA 的溫度。引物的 Tm值通常要在 52~58 ℃ 之間。

GC 含量。最適合的 GC 含量為 40~60%。

就目前而言很多軟體都可以用來設計引物，如 primer 5 和 Oligo。通常這些軟體設計得到的引物均可以滿足需要。

PCR 操作流程

PCR 由變性——退火——延伸三個基本反應步驟構成。

準備好各種試劑和 PCR 儀，就可以開始 PCR 實驗：將各種試劑混合并按照說明書設置 PCR 反應。一般 PCR 循環如下：

起始步驟：這對於熱啟動 PCR 而言是必須的，將反應混合液加熱至 94~98 ℃ 以激活 DNA 聚合酶。這一步的時間取決於所選用的 DNA 聚合酶。

變性步驟：DNA 本身是雙鏈結構，而 DNA 擴增需要引物與單鏈 DNA 模板相結合。在這一步，反應混合液被加熱至 94～98 ℃ 保持 20～30 秒以破壞雙鏈間的氫鍵以便釋放出單鏈 DNA。這是 PCR 循環中的第一步。

退火步驟：變性之後，DNA 模板以單鏈的形式在反應混合液中存在。因為反應體系中的引物與 DNA 模板互補，當反應溫度降至 50~65 ℃ 時，引物與互補的序列形成氫鍵。退火溫度主要取決於引物的 Tm 值，通常比引物 Tm值低 3～5 ℃。這一步通常維持 20～40 秒，而聚合酶會結合至引物-模板雙鏈處開始 DNA 合成。

延伸步驟：在這一步，DNA 聚合酶開始 DNA 合成，因此這一步的溫度選取的是 DNA 聚合酶的最優溫度。通常我們選用 72 ℃，但某些 DNA 聚合酶的最適溫度是 68 ℃。這一步與體內的 DNA 複製很相似：DNA 聚合酶按照鹼基互補規律將 dNTPs 加到引物的 3』 末端最終得到新的 DNA 雙鏈片段。延伸時間取決於目的 DNA 片段的長度和 DNA 聚合酶的合成能力。一般而言 DNA 聚合酶每 60 秒能夠合成 1 kb 長度的 DNA。

循環：第 2 步至第 4 步稱為一個循環。每次循環之後 DNA 的量均是前一次的兩倍。通常一次 PCR 反應進行 30~35 個循環。在前幾輪的 PCR 循環過程中 PCR 產物的量以指數速率增長，但是到了反應後期隨著 dNTPs 和引物的量的減少以及 DNA 聚合酶的失活，反應速率逐漸下降，因此 PCR 反應的產量也受到了限制。

最後的延伸步驟：當 30~35 個循環結束後，我們通常會以 68~74 ℃ 延伸 5~10 分鐘，這是希望使反應體系中殘留的單鏈 DNA 全部反應完畢。

保存溫度：通常我們設置 4~10 ℃ 為反應後 PCR 產物的保存溫度。

每完成一個循環需 2～4 分鐘，2～3 小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平台期 (Plateau) 所需循環次數取決於樣品中模板的拷貝。PCR 的反應動力學 PCR 的三個反應步驟反覆進行，使 DNA 擴增量呈指數上升。

反應最終的 DNA 擴增量可用 Y=(1+X)n計算。Y 代表 DNA 片段擴增後的拷貝數，X 表示平均每次的擴增效率，n 代表循環次數。平均擴增效率的理論值為 100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。

反應初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指數形式，隨著 PCR 產物的逐漸積累，被擴增的 DNA 片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現「停滯效應」，這種效應稱平台期數、PCR 擴增效率及 DNA 聚合酶 PCR 的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。

PCR 擴增產物可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈 5』 端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由於引物所結合的模板不一樣而形成的。

以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的 DNA 為模板，引物是從 3』 端開始延伸，其 5』 端是固定的，3』 端則沒有固定的止點，長短不一，這就是「長產物片段」。進入第二周期後，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈 (即「長產物片段」) 結合。引物在與新鏈結合時，由於新鏈模板的 5』 端序列是固定的，這就等於這次延伸的片段 3』 端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定於引物擴增序列以內、形成長短一致的「短產物片段」。

不難看出「短產物片段」是按指數倍數增加，而「長產物片段」則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計，這使得 PCR 的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純 DNA 片段供分析與檢測用。

二

PCR 常見問題原因及對策

無擴增條帶

酶失活或在反應體系中未加入酶。TaqDNA 聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。

模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成 DNA 脫嘌呤而影響 PCR 的結果。

變性溫度是否準確：PCR 儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環就迅速失活；過低則模板變性不徹底。

反應系統中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加 Taq 酶以前，將反應體系 95 ℃ 加熱 5~10 分鐘。

引物變質失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件不當而失活。

引物錯誤。利用 BLAST 檢查引物特異性或重新設計引物。

DNA 凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是 DNA 凝膠和 PCR 程序的問題。

PCR 產物量過少

退火溫度不合適。以 2 ℃ 為梯度設計梯度 PCR 反應優化退火溫度。

DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。

PCR 循環數不足。增加反應循環數。

引物量不足。增加體系中引物含量。

延伸時間太短。以 1 kb/分鐘的原則設置延伸時間。

變性時間過長。變性時間過長會導致 DNA 聚合酶失活。

DNA 模板中存在抑制劑。確保 DNA 模板乾淨。

擴增產物在凝膠呈彌散狀

酶量過高。減少酶量；酶的質量差，調換另一來源的酶。

dNTP 濃度過高。減少 dNTP 的濃度。

MgCl2濃度過高。可適當降低其用量。

模板量過多。質粒 DNA 的用量應 < 50 ng，而基因組 DNA 則應 < 200 ng。

引物濃度不夠優化。對引物進行梯度稀釋重複 PCR 反應。

循環次數過多。增加模板量減少循環次數至 30，縮短退火時間及延伸時間，或改用兩種溫度的 PCR 循環。

退火溫度過低。

電泳體系有問題：

凝膠中緩衝液和電泳緩衝液濃度相差太大；

凝膠沒有凝固好；

瓊脂糖質量差。

若為 PCR 試劑盒則可能：

由於運輸儲存不當引起試劑盒失效；

試劑盒本身質量有問題，如引物選擇、循環參數等選擇不當。

降解的陳舊模板擴增也易產生塗布。

擴增產物出現多條帶（雜帶）

引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。

循環的次數過多。適當增加模板的量，減少循環次數。

酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。

退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可採用二種溫度的 PCR 擴增。以 2 ℃ 為梯度設計梯度 PCR 反應優化退火溫度。

樣品處理不當。

Mg2+濃度偏高，因適當調整 Mg2+使用濃度。

若為 PCR 試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。

複製提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發生。冰上準備反應體系或採用熱啟動聚合酶。

反應緩衝液未完全融化或未充分混勻。確保反應緩衝液融化完全並徹底混勻。

引物特異性差。利用 BLAST 檢查引物特異性或重新設計引物。

引物量過多。減少反應體系中引物的用量。

模板量過多。質粒 DNA 的用量應 < 50 ng，而基因組 DNA 則應 < 200 ng。

外源 DNA 污染。確保操作的潔凈。

陰性對照出現條帶

試劑，槍頭，工作台污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作台進行清潔。

條帶大小與理論不符

污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作台進行清潔。

模板或引物使用錯誤。更換引物和模板。

基因亞型。對研究的基因進行序列分析和 BLAST 研究。

獻給初學者系列

文章來源：英格恩生物

圖片來源：英格恩生物