基因測序「摩爾定律」初現，「三代測序」要革「二代」的命？

知識 06-25

近期，興證醫藥健康發布了一篇關於三代基因測序行業介紹的報告，動脈網認為這份報告有助於醫療從業者對三代測序技術和市場前景有一個全方位的了解，因而進行了轉載和整理。

在「二代測序」（NGS）尚未迎來投資熱潮的情況下，技術突破捷報連連的「三代測序」（3GS）又進入到了投資人的視野中。1986年，第一台商用基因測序設備正式出現，到第二代測序設備出現，期間間隔了19年時間。而第二代設備問世，到第三代設備的誕生，僅僅用了5年，基因測序設備的更新換代速度正在不斷加快。這就好比「2G」手機跳過「3G」，直接跨越到了「4G」時代。

報告通過四個方面對第三代基因測試技術進行分析：

第三代基因測試技術的發展現狀；

第三代基因測試方法原理；

第三代極影測試技術優勢和劣勢；

國內外布局第三代基因測試技術的公司情況。

第三代基因測試技術的發展現狀

以Helicos公司的Heliscope單分子測序儀、Pacific Biosciences公司的SMRT技術和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術為代表的三代測序技術在經過了多年發展後，已經逐步趨於成熟。

儘管當下該技術還有成本偏高、錯誤率較高、生物信息學分析軟體不夠豐富的問題，但其在讀長、測序速度等方面都具有明顯優勢。

三代測序設備已實現穩定性、小型化，未來隨著準確度提升、平行測序能力和酶活性等問題的解決，第三代測序技術將成為未來發展的重要技術趨勢，實現大規模商業化將是大勢所趨。

第三代基因測序方法原理

Helicos公司的Heliscope單分子測序儀、Pacific Biosciences公司的SMRT技術和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術，被認為是第三代測序技術。

與前兩代技術相比，他們最大的特點是單分子測序，其中，Heliscope技術和SMRT技術利用熒光信號進行測序，而納米孔單分子測序技術利用不同鹼基產生的電信號進行測序。

PacBio SMRT技術應用了邊合成邊測序的思想，並以SMRT晶元為測序載體，晶元上有很多小孔，每個孔中均有DNA聚合酶。

測序基本原理是：DNA聚合酶和模板結合,4色熒游標記4種鹼基（即是dNTP）,在鹼基配對階段,不同鹼基的加入,會發出不同光,根據光的波長與峰值可判斷進入的鹼基類型。DNA聚合酶是實現超長讀長的關鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關,它主要受激光對其造成的損傷所影響。

另外，可以通過檢測相鄰兩個鹼基之間的測序時間，來檢測一些鹼基修飾情況，既如果鹼基存在修飾，則通過聚合酶時的速度會減慢，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過這個來之間檢測甲基化等信息。SMRT技術的測序速度很快，每秒約數個dNTP。

但是，同時其測序錯誤率比較高（這幾乎是目前單分子測序技術的通病），達到15%。但好在它的出錯是隨機的，並不會像第二代測序技術那樣存在測序錯誤的偏向，因而可以通過多次測序來進行有效的糾錯（代價是重複測序，也就是成本會增加）。

基因測序「摩爾定律」初現，「三代測序」要革「二代」的命？

SMRT技術原理圖

Oxford Nanopore Technologies公司所開發的納米單分子測序技術與以往的測序技術皆不同，它是基於電信號而不是光信號的測序技術。

該技術的關鍵之一是，設計了一種特殊的納米孔（只能容納單分子通過），孔內共價結合有分子接頭。當DNA鹼基通過納米孔時，它們使電荷發生變化，從而短暫地影響流過納米孔的電流強度（每種鹼基所影響的電流變化幅度是不同的），靈敏的電子設備檢測到這些變化從而鑒定所通過的鹼基。

基因測序「摩爾定律」初現，「三代測序」要革「二代」的命？

Nanopore技術原理圖

第三代基因測序技術的優勢和劣勢

相比於二代測序，三代測序具有如下優勢：

第三代基因測序讀長較長。如Pacific Biosciences公司的PACBIO RS II 的平均讀長達到10kb，可以減少生物信息學中的拼接成本，也節省了內存和計算時間。

直接對原始DNA樣本進行測序，從作用原理上避免了PCR擴增帶來的出錯。

拓展了測序技術的應用領域。二代測序技術大部分應用基於DNA，三代測序還有兩個應用是二代測序所不具備的：第一個是直接測RNA的序列，RNA的直接測序，將大大降低體外逆轉錄產生的系統誤差。第二個是直接測甲基化的DNA序列。實際上DNA聚合酶複製A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時間不同，根據這個不同的時間，可以判斷模板的C是否甲基化。

三代測序在ctDNA，單細胞測序中具有很大的優勢：ctDNA含量非常低，三代測序技術靈敏度高，能夠對於1ng以下做到監測；在單細胞級別：二代測序要把DNA提取出來打碎測序，三代測序直接對原始DNA測序，細胞裂解原位測序，是三代測序的殺手應用。

同時，第三代基因測序也存在一定的缺陷：

總體上單讀長的錯誤率依然偏高，成為限制其商業應用開展的重要原因；第三代基因測序技術目前的錯誤率在15%-40%，極大地高於二代測序技術NGS的錯誤率（低於1%）。不過好在三代的錯誤是完全隨機發生的，可以靠覆蓋度來糾錯（但這要增加測序成本）。

三代測序技術依賴DNA聚合酶的活性。

成本較高，二代Illumina的測序成本是每100萬個鹼基0.05-0.15美元，三代測序成本是每100萬個鹼基0.33-1.00美元。

生信分析軟體也不夠豐富（如圖所示）：

基因測序「摩爾定律」初現，「三代測序」要革「二代」的命？

一、二、三代基因測序技術對比圖

國內外布局三代測序的公司情況

國外布局三代測序的主要有Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies等公司，2015年10月27日，國內公司瀚海基因（Direct Genomics）公布了基於Helicos技術研發的專門用於臨床的第三代單分子測序儀GenoCare 原理樣機。

中科院北京基因組研究所與浪潮基因組科學也在共同研製國產第三代基因測序儀。在測序儀價格方面，PACBIO 2011年的第一台三代測序儀PacBioRS在美國價格80萬美金，2015年生產的sequel測序儀價格35萬美金，大幅下降。在測序成本方面，預計未來5年內三代測序能達到100美元全基因組測序的價格。

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