超分辨顯微，至極至美！

導語

三個物理學家，因為對生命科學的貢獻，贏得2014年的諾貝爾化學獎。他

們做了什麼重大貢獻？恩斯特·阿貝為常規光學顯微鏡的解析度設定了一個限制——半波長極限。貝齊格、赫爾和莫納將已知的技術推至極限，最早探測到凝聚態體系中的單個熒光分子，利用熒光分子的開關效應，加上物理教科書上的受激輻射原理和數據分析中常用的擬合定位方法，繞開了這個似乎不能突破的極限。他們將光學顯微技術帶入到納米尺度，引發了常溫下活體生物學研究的又一場革命。他們對科學的追求堪稱至極至美。這樣的典範將來還會有，尤其是在物理學與生命科學的交叉領域。

2014 年的諾貝爾化學獎授予了三位物理學家：埃里克·貝齊格(Eric Betzig)、斯特凡·赫爾(Stefan Hell)和威廉·莫納(William E. Moerner)。他們將技術推至極限，最早探測到凝聚物質系中的單個熒光分子，然後發現了熒光分子的開關效應，並巧妙利用物理教科書上的受激輻射原理和數據分析中常用的擬合定位法，將光學顯微鏡的解析度提高至納米尺度。這類技術從誕生到現在還不到二十年，卻已對多個領域產生了重大影響，並將在未來給生命科學帶來更多革命性的變化。

自恩斯特·阿貝(Ernst Abbe)1873年發表著名的阿貝解析度極限公式以來，人們一直認定顯微鏡的解析度只有光波長的一半(見圖2)。對可見光而言，這個數值大約是250 nm。於是，物理學家很自然地將思路轉向波長更短的射線，發明了電子顯微鏡和X射線顯微鏡。這兩種顯微鏡都能達到納米甚至更高的解析度。可惜這兩種顯微鏡都不是生物學家的最愛。他們更喜愛能在常溫下對活體進行有效且無損觀察的光學顯微鏡，特別感興趣的尺度是10 nm左右，這大約是一個普通蛋白質的尺寸。但阿貝解析度極限讓他們斷了念想。例如，一個大腸桿菌的尺寸大約是300 nm寬，500 nm長。在其中放入兩個發光的分子就超出了光學顯微鏡的分辨能力。這個解析度極限似乎限制了人們的思路，一百多年來光學顯微技術一直沒有重要進展。阿貝的公式沒有錯，它源自嚴密的物理學推演，並在實踐中經受了嚴格的檢驗。錯的是人們忽略了阿貝極限存在的條件：單一物鏡的傳統光學顯微鏡；觀察目標的發光不可控。改變其中任何一個條件，都有可能讓光學顯微鏡繞開阿貝極限。這正是本年度諾貝爾化學獎獲得者所做的事情。科學史上這樣的例子絕不只這一個，只可惜人們在驚羨過後很快就忘了自己或許也該有這樣的機會。當然，他們的成功也不是一蹴而就的，而是源自單分子顯微鏡技術艱辛發展道路上的一系列重要突破。此次諾貝爾化學獎獲得者之一莫納在1989 年任職於美國 IBM 研究中心時，成為世界上第一個測量單個分子光吸收的科學家，這正是單分子熒光顯微鏡成功的關鍵。不要小看這個在現在看來不難實現的測量，以當時的技術條件，這幾乎就是天方夜譚。但莫納和他的團隊就是想挑戰一下光學測量技術的極限，結果獲得了成功。它帶來的震撼不亞於當年愛因斯坦用布朗運動證實分子的真實性對懷疑論者的衝擊。沒想到事情的發展是那麼富有戲劇性。此後單分子檢測一路凱歌，由低溫發展到可在室溫下進行，並且陸續實現了固體、微滴和溶液中的單分子熒光檢測。室溫下溶液中單分子檢測的實現為以後在實際生物體系中的應用提供了可能性。莫納的又一個重要貢獻是他與2008年度諾貝爾化學獎獲得者錢永健等一起發現了單個熒光分子的「開關」效應。該效應被等待了多年的另一位獲獎者貝齊格用來實現他1995年的設想，並於2006年證實可以獲得超越阿貝極限的顯微成像。

貝齊格的方法是這樣的(見圖3)：控制熒光分子，每次只讓少量幾個熒光分子發光，用CCD記錄並擬合每個熒光分子像的中心位置，以時間來換空間，將多次觀察得到的位置信息拼湊起來得到完整的圖像。很顯然，這樣得到的圖像的解析度取決於單分子像之中心位置的擬合精度。目前一般情況下可以達到10 nm量級，這正是生物學家多年來所企盼的解析度。多年後，當莫納被問到為什麼沒有想到將自己的發現用於顯微鏡研究時，莫納只能很尷尬地說自己確實很笨。我們看到，大師莫納也有頭腦沒有準備好的時候。可見，知識的廣度與深度是多麼重要，除了有一顆勇於創新的心，還要有一個不斷思考的腦。

與莫納一直處於優雅的學術殿堂相比，貝齊格的學術生涯還帶點傳奇色彩。貝齊格在1990年代研究近場光學顯微技術(SNOM)，是當時這個領域最好的研究者之一，在Science雜誌上發表了一系列重要文章。不過，他追求的不是發表多少文章，而是超越極限的理想。當他意識到用SNOM 不可能將光學顯微技術的分辨能力推至納米極限後，失望地離開了科學界，去了他父親的公司做工程師。但這位曾首次在室溫下獲得單分子熒光光譜的科學家，並不是狼狽地逃離，而是在離開之前(1995年)拋出了一篇奠基性文章，提出了我們現在稱之為光激活定位顯微術(photoactive localization microscopy，PALM)的理論思路。兩年後莫納與錢永健等發現了熒光蛋白的「開關」效應。隨後Lippincott-Schwartz等在2002年發明了光敏綠色熒光蛋白。貝齊格意識到他可以藉此實現自己1995年的設想，並與合作者一道發明了PALM顯微鏡。該成果於2006年發表在Science雜誌上。

在光學顯微鏡的發展史上，2006年是一個奇蹟年。在這一年，三個研究小組幾乎同時報道了超分辨顯微鏡。Samuel Hess 小組是其中之一。2005 年夏天，還是緬因州州立大學物理系助理教授的Hess，一直在與化學教授和生物學教授就如何提高觀察活細胞脂筏結構的解析度等問題進行交流。有一天他突然靈光閃現，設計了與貝齊格思路相似的顯微鏡，並與合作者一道組裝好顯微鏡。2006年，他們在Biophysical Journal期刊上發表了他們的研究成果。令人稱奇的是，他們用了幾乎相同的名字來命名他們的技術：熒光光敏定位顯微鏡(fluorescence photoactivation localization microscopy， FPALM)。同一時間段，哈佛大學的庄小威小組也在研究熒光成像技術。她的研究小組在2004年發現有一些花青染料可以用作光敏開關，並於2006年在Nature Methods 期刊上發表了她們稱之為隨機光學重構顯微術(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)的成果。

與上面提到的一群學術大師一樣，斯特凡·赫爾也一直對阿貝極限耿耿於懷，只不過在學術上他更像一位孤膽英雄。赫爾在發明超分辨顯微鏡之前的傳奇一點不比貝齊格遜色。但他做的事情不是在小有成就之後離開學術界，而是一直在為得到承認而辛苦奔波。在讀博士期間，赫爾發現如果不拘泥於使用單個顯微鏡物鏡，而是將兩個高數值孔徑的物鏡頭對頭組合在一起，可以提高光學顯微鏡沿光軸方向的解析度。博士畢業後，他獨自一人繼續在家研究以上問題，並最終成功發明了4Pi顯微鏡。可惜這並不被當時的主流學術界所重視，因為他只是將顯微鏡沿光軸方向的解析度提高了幾倍而已。他只好一個博士後接著一個博士後地輾轉於歐洲各地。1994年，赫爾在翻閱量子力學書籍時突然想到可以利用分子的受激輻射達到目的。他的設想是(見圖4)：用一束激光激發熒光分子，很自然地，點擴散函數所覆蓋範圍內的分子都會被激發。此時若用另一束激光讓點擴散函數中心點外圍的熒光通過受激輻射回到基態，就只剩下納米尺度內的分子發射自發輻射熒光並被探測器記錄。這樣，通過掃描樣品即可呈現出遠遠高於阿貝極限的顯微圖像。這就是現在所謂的受激輻射損耗技術(stimulated emission depletion， STED)。

1994 年，赫爾在 Optics Letters 期刊上發表了他的理論文章。多年以後這項理論才得以在實踐中被證實。在那段時間裡，赫爾一邊繼續科研工作，一邊四處奔走籌集科研經費。赫爾的研究終於得到德國馬克斯-普朗克研究所的認可，回到德國後他成功驗證了自己的設想。受激輻射損耗技術(STED)看起來更符合物理學家的品位，所以使用起來也稍微複雜一點。當然，其最根本的基礎還是莫納等所奠定的單分子熒光成像技術。1999年，赫爾將他的研究成果前後投給Nature和Science雜誌，不過都被退稿。直到2000年，美國科學院院刊PNAS才發表了他的成果。採用STED技術，人們第一次得到了納米級的熒光圖像。回憶一下，你是不是也曾經有過類似的靈感？只可惜，或許你想了一下就放下了。超分辨顯微技術是對分子科學的重大貢獻，它對生物醫學研究的影響更是革命性的。它讓人們能夠觀察到活生生的納米尺度的生命現象。

藉助超分辨顯微技術的強大威力，今天的我們能夠從最微小的分子細節著手來研究活細胞(見圖5)。這在前人看來簡直是不可思議的事情。正如諾貝爾化學獎評選委員指出的那樣，利用分子的熒光，科學家們可以監測細胞內部分子之間的相互作用，也可以觀察與疾病相關的蛋白質聚合現象，在納米世界裡追蹤細胞的分裂。如今，納米顯微鏡已在世界各地被廣泛運用，每天人類都能從其帶來的新知識中獲益。今年的三位諾貝爾化學獎得主都是物理學博士，他們獲獎的成果是典型的跨學科研究成果。這是物理思想、光學技術和分子探針相結合的產物，是又一個技術型諾貝爾獎。生命科學和醫學領域大量的懸疑正持續吸引著具有不同專業背景的有識之士，學科的交叉融合將大力促進生物醫學研究的進步。毋庸置疑，未來我們還將看到更多像這樣的諾貝爾獎級別的跨界研究成果。下一個摘取桂冠的會不會是你？或許就是你，只要你不被所謂的主流所迷惑，不被現有的成規所羈絆，並有一個勇於探索的心。

本期編輯|以太

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