環狀RNA定量PCR技術詳解

知識 07-19

環狀RNA研究正在全世界如火如荼的進行，各種針對環狀RNA檢測的技術方法也不斷出現，其中對特定環狀RNA進行定量分析是環狀RNA研究中必須要解決的問題。今天山人就跟大家一起分享一下環狀RNA定量分析的技術要點。（註：本文定量PCR技術以染料法為主，TaqMan探針法暫不做介紹，不便之處敬請諒解。）

第二屆環狀RNA研究論壇火熱報名中。。。[推廣]

實驗設計與樣品準備：

首先，我在此向各位讀者表示誠摯的歉意，在上一期的《環狀RNA實驗流程詳解》中，我因為不嚴謹，導致有個實驗細節寫錯了，非常抱歉！在此，山人也向各位讀者鄭重承諾，以後一定盡量不再犯同樣的錯誤。更正後的內容如下：

進行RNase R消化：獲得的RNA樣品用52μL DEPC水重懸，一分為二，其中一份進行RNase R消化，另一份做對照。RNase R消化組加3μL 10×RNase R Reaction Buffer，1μL RNase R (20 U/μl)，（不消化的組加1μLDEPC水），37 °C for 1–2 h。消化結束後加30μL 酚-氯仿-異戊醇，震蕩混勻以終止消化，13000× g， 4 °C 離心 5 min。上清轉移至新的RNase Free的離心管中，用6μL 4 M氯化鋰，1μL糖原，90μL預冷無水乙醇顛倒重懸，?80 °C沉澱1h，也可以直接放置在?80 °C，直到準備下一步實驗時。實驗前用13000× g， 4 °C 離心 20 min，用75%預冷乙醇洗滌兩次，風乾後20μLDEPC水溶解即可用於下一步的實驗。

進行環狀RNA定量PCR分析，對照組的選擇比較重要，需要考慮各個主要實驗步驟中可能存在的干擾因素：

首先，需要進行RNase R消化與不消化處理的對照。這個對照的目的是排除線性RNA中可能存在的能被所設計的環狀RNA定量PCR引物擴增的干擾序列。

其次，建議增加不反轉的對照或增加DNase I消化條件。因為RNA提取過程中很難完全避免DNA的污染，因此在進行定量PCR實驗過程中還需要排除DNA序列污染的可能性，增加DNase I消化並加上不反轉的RNA樣品直接作為模板的對照即可清除的排除這一潛在干擾條件。

再次，需要考慮內參的選擇問題。環狀RNA的定量一般會與對應的線性RNA進行比較，因此不同環狀RNA的含量高低很難有統一的內參，尤其是各個實驗體系中穩定表達的環狀RNA還沒有明確的定論。關於如何選擇內參這個問題，山人的愚見是間接的通過與線性RNA表達量進行比較，線性RNA研究相對成熟，也有認可度較高的內參，在實驗設計過程中不經過RNase R消化的組可以直接用常規內參進行定量比較，同樣的樣品經過RNase R消化後不同基因所對應的環狀RNA含量比例可以假設是不受影響的，這樣就可以基於線性RNA的內參數據進行間接的環狀RNA定量分析。

最後，需要考慮可能存在的環狀RNA非線性反轉錄擴增的可能性。如下圖所示，環狀RNA特殊的結構導致它可能會被以「滾環」方式進行非線性的反轉錄擴增，這樣的cDNA中同時具有多個環化位點的序列，因此定量PCR的結果可能會被放大。這樣的情況可以通過PCR產物電泳和條帶分離鑒定甄別。這個問題或許也可以考慮通過優化反轉錄條件（引入特異性引物進行反轉錄？）或選擇反轉錄過程中消化RNA模板能力更強的反轉錄酶進行優化。

環狀RNA定量PCR技術詳解

圖1 環狀RNA分析引物擴增獲得多條帶原因的理論分析模型（來自 (Barrett and Salzman, 2016)）

引物設計：

目前認為環狀RNA是RNA剪切過程中反向拼接後形成的，環狀RNA與所對應的線性RNA最大的差別在環化位點周圍。這極大的限制了環狀RNA的定量PCR引物設計。因此環狀RNA定量PCR引物核心是保證特異性，盡量符合定量PCR基本要求。引物設計主要原則如下：

引物設計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點擴增。具體實現這3條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度，產物長度，序列Tm值，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性，形成引物二聚體及髮夾結構的能值，在錯配位點的引發效率，引物及產物的GC含量等等。

1）引物的長度一般為15-25 bp，常用的是18-23 bp，不建議大於30bp，因為過長會導致其退火溫度過高，不適於定量PCR反應。

2）引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3』端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3』端出現3個以上的連續鹼基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加。引物內部及引物之間最好不要有超過4個鹼基的連續互補序列。

3）引物3』端的末位鹼基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位鹼基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位鹼基為A的錯配效率明顯高於其他3個鹼基，因此應當避免在引物的3』端使用鹼基A。另外，引物二聚體或髮夾結構也可能導致PCR反應失敗。5』端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。

4）引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5）引物二聚體及髮夾結構的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

6）定量PCR擴增片段長度一般在80-150bp為宜，產物盡量不要有二級結構，鹼基盡量隨進分布，避免局部GC含量過高的情況，擴增片段總GC含量盡量不要超過60%。

常用軟體：

軟體的引物設計功能主要體現在兩個方面：首先是引物分析評價功能，該功能只有少數商業版軟體能夠做到，其中以「Oligo 6」最優秀；其次是引物的自動搜索功能，各種軟體在這方面的側重點不同，因此自動搜索的結果也不盡相同。據筆者的經驗，自動搜索功能以「Premier Primer」為最強且方便使用，「Oligo 6」其次，其他軟體如「Vector NTI Suit」、「Dnasis」、「Omiga」和「Dnastar」都帶有引物自動搜索功能，但搜索結果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自動搜索的基礎上還要輔以人工分析。

此外，最近的一些報道表明環狀RNA中還可能存在特殊的RNA拼接機制，因此除了環化位點，對於那些清楚的知悉完整序列的環狀RNA分子中或許還有可能設計出環狀RNA特有序列的定量PCR引物。目前還沒有這一類的定量PCR引物報道，但理論上是完全可行的，大家值得一試。

PCR實驗流程：

定量PCR的體系一般都是2×的預混液，反應體系只需要補充引物和模板即可，一般引物濃度100-400mM，模板依據具體實驗優化，建議內參Ct值在15-20之間為佳。為減少操作誤差，一般會用三個復孔進行實驗。PCR條件依據所選擇的定量PCR 試劑說明書進行。最後用程序默認設置進行溶劑曲線測定。

為保持實驗體系穩定，建議盡量減少預混體系的反覆凍融次數，實驗過程中盡量避免強光直接照射樣品和預混液。

結果分析與常見問題釋疑：

影響Ct值的主要因素：1. 模板濃度；2. 反應體系成分，如pH，鹽濃度等；3. PCR擴增效率，理論上每個循環會獲得擴增2倍的模板，但實際會因為各種原因或多或少偏離這一理想狀態，嚴謹的實驗需要進行引物和體系擴增效率預實驗，一般會平行做三次5個數量級以上稀釋倍數的模板濃度梯度分析，擴增效率在90-110%的範圍內屬於比較理想的情況。具體QPCR拷貝數計算不在此做詳述。

常見問題：

1. 沒有Ct值：在溶解曲線中沒有「起峰」。首先考慮手否由於模板降解或濃度太低所導致，還有可能是儀器參數設置有誤導致的。

2. Ct值太大：首先考慮是否模板濃度不恰當所致，也可能是引物或模板降解，還有可能是擴增片段太大導致的。

3. 陰性對照有Ct值讀數：首先考慮反應體系污染的可能，實驗環境尤其是移液槍內部如果曾有模板物質的污染，非常有可能引入假陽性信號，如遇到這類情況建議清洗或更換相關實驗用品，也可在定量PCR體系中引入尿嘧啶糖苷酶體系避免污染後續實驗。

4. 溶解曲線出現多個峰：最有可能的是引物特異性不夠或二聚體及髮夾結構等造成的。此外也可能是引物濃度，鎂離子濃度不佳所致，還有可能是基因組污染導致。

5. 溶解曲線異常，如S形等奇特的形狀：可以考慮是否由於設備參數中染料選擇不正確或者反應體系中染料被漂白失活等因素。

數字PCR對環狀RNA研究的價值：

定量PCR檢測是生命科學研究的重要基本實驗技術，除了燃料法和探針法的定量PCR技術，一些新興的定量分析技術也非常值得關注。其中數字PCR就特別有用。

目前市面上有兩種數字PCR體系：BioRad的微滴式數字PCR體系以及Thermo的基於晶元微室的數字PCR體系。數字PCR基本原理是利用物理學方法結合合適的稀釋條件使得每個擴增單元中含有盡量少的模板，理論上可以有一個模板分子或者沒有。這樣在每個擴增單元中都要麼通過高循環數的擴增，從單個模板擴增得到有明確信號的產物，或者因為沒有模板而呈現陰性信號，最終在檢測器中讀出有陽性信號的擴增單元數目，這樣就可以實現絕對定量。BioRad的微滴式數字PCR體系構建單個擴增單元是基於「油包水」的小微滴實現，Thermo的數字PCR體系則是在晶元中構建隔離的微室作為擴增單元。兩種體系各有優劣，在此不做詳細分析。

數字PCR對於環狀RNA的研究非常有價值，這種定量PCR技術理論上可以實現絕對定量，對引物和擴增片段的要求比常規的定量PCR要低很多，因此可以大大提高引物和擴增片段的選擇空間，這對於環狀RNA的定量分析非常有益。

參考文獻：

Barrett, S.P., and Salzman, J. (2016). Circular RNAs: analysis, ex pression and potential functions. Development 143, 1838-1847.

文 | circRNA 吉賽生物

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