實驗新人必讀（三）：細胞污染鑒別、處理技能全get
作者：解螺旋. 刀王
導語
作為科研新人，你難免會遇到細胞污染這件事兒？別哭的稀里嘩啦！還是擦乾眼淚看看前人的總結吧，以免在細胞污染的路上越走越遠了。
細胞培養中常見的生物污染類型有7種，分別是細菌污染、支原體污染、原蟲污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及非細胞污染。
細胞培養中污染的特點如下
細菌：細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，根據感染細菌的不同，可有不同的外形，培養液一般會渾濁變黃，對細胞生長影響明顯。
支原體：黑色的，好象多為多形，培養液一般培養液一般會渾濁，原體感染，國內血清很多都沒有做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中最常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細胞以後，細胞病變不很明顯，只是慢慢死去。
黑膠蟲：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點狀，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去，培養液也是不渾的，一般不會太影響，細胞還是可以用的。常常是細胞生長狀態良好，且觀測到的運動物無明顯增多，且培養液顏色、透明度無明顯變化，可在同一批號的血清養的細胞中發現類似現象。對細胞生長狀態不會有明顯影響，在細胞增殖旺盛之後會自然消失，除更換血清外無須特殊處理。
真菌：一般培養液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些真菌開始很像死細胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細胞碎片分不清，慢慢的會長出很細的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細菌那麼容易被發現，但是一旦發現有它的存在細胞就被污染了，也很難救活了。
原蟲：培養液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細小的點狀物數量非常多，輕微活動，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細胞狀態不好，邊緣不清楚，細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養。這種共生是非常普遍的，但他們的數量小，細胞站優勢所以不會影響到細胞的正常生長，只有當他們到達一定的數量時就會影響到細胞的生長，最終形成惡性循環。
病毒：組織細胞培養過程中，如果沒有除去潛在的病毒，就會產生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養中已發現不少於20種血清性病毒。
儘管病毒污染的細胞不影響原代培養，但生產疫苗是不安全的。因此，潛在病毒是細胞大量生產和疫苗、干擾素等生物製品製作中的難題。
非同種細胞污染 ：即是細胞交叉污染，由於細胞培養操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。非細胞培養物所造成的化學成分的污染也偶有發生，大多是由於細胞培養所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學物質所致。
細胞培養中疑似污染的案例
洋蔥佰克霍爾德菌（Burkholderiacepacia）原屬假單胞菌屬，是植物病原菌，因引起洋蔥患病而得名，是醫院感染病原菌之一。
洋蔥伯克霍爾德菌是一種廣泛存在於土壤及水中，與醫院感染密切相關的革蘭陰性桿菌，尤其為免疫缺陷及肺囊性纖維化患者易感染細菌之一。它可以在無糖的培養基中生長。在醫院環境中常可污染自來水、體溫表、噴霧器、靜脈導管、導尿管、靜脈輸液管等，造成院內傳播，導致多種醫院感染，如敗血症、心內膜炎、肺炎、傷口感染、深部膿腫和眼結膜炎等，尤其採用導管植入進行治療者，更容易引起感染。洋蔥伯克霍爾德菌對多種抗菌葯具有天然的耐藥性。耐葯現象嚴重，治療可選擇復方磺胺甲繟唑、哌拉西林,三唑巴坦、哌拉西林和頭孢他啶等抗菌藥物。
白色念珠菌污染（倒置）， 白色鏈球菌是常見的細胞污染
革蘭氏染液染色的鏈球菌
中間長梭型的是正在分裂的念珠菌
真菌感染
支原體污染
黴菌污染
確切的說應該屬於絲霉，因為你可以看到明顯的菌絲，有些種類是無橫隔的，有的是具橫隔的，培養基呈淡紫色，或不變色，但會變得粘稠。
污染來源，一般是來自實驗服，並且具有季節性，像現在這種長蘑菇的季節很容易污染這種菌類。
細菌污染
你在倒置顯微鏡下無法看到細菌的結構（需油鏡），污染晚期培養基呈黃色。
蟎蟲污染
這個是原代培養皮膚成纖維細胞時污染的，形態呈桿狀，能自主直線遊動，速度相當快。。污染源：小鼠毛髮中。。。
酵母污染
鏡下能隱約看到出芽生殖，不過不知道酵母會不會呈團聚集在一起，因為照片中那團黃色的東西也是此污染物，肉眼觀察使可看到明顯的白色或淡黃色顆粒狀的漂浮物，同樣這個污染源也是小鼠的皮膚
污染的清除
培養細胞一經污染，多數較難處理。如果污染細胞價值不大，宜棄之;在尋找原因後徹底消毒操作室，復甦或重新購置細胞，再培養。
若污染細胞價值較大，又難於重新得到，可採取以下辦法清除。
一、細菌和真菌的清除
使用抗生素
抗生素對殺滅細菌較有效。聯合用藥比單獨用藥效果好。預防用藥比污染後再用藥效果好。預防用藥一般用雙抗生素，污染後清除用藥需採用大於常用量5～10倍的沖洗法，於加藥後作用24～48小時，再換常規培養液。此法在污染早期有效。
二、支原體的清除
1、用MRA處理
用MRA(Mycoplasma Removal Agent)處理細胞，每4天換一次液,連續處理15天以確保細胞純潔健康，效果好。
2、用清洗純化法清除支原體污染的方法
細胞營養馴化優質細胞群的篩選細胞清洗反覆離心洗滌
其原理是利用離心力、細胞、微生物質量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由於支原體個體小且除發酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過反覆洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數量降低至極限。
如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。
3、藥物輔助加溫處理
先用藥物處理後，再將污染的組織培養物放在41℃培養18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。
4、使用支原體特異性血清
用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長，故經抗血清處理後11天即轉為陰性，並且5個月後仍為陰性。但此法比較麻煩，不如用抗生素方便、經濟。
污染的預防
預防是防止細胞培養過程中發生污染的最好辦法。只有預防工作做在前，才能將發生污染的可能性降到最小程度。
一般預防可從以下幾方面著手：
1、添加抗生素
2、從物品、用品消毒滅菌著手
細胞培養所用物品清洗、消毒要徹底，各種溶液滅菌除菌要仔細，並在無菌試驗陰性後才能使用。
操作室及剩餘的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。
3、從操作者做起
(1)進無菌室前要用肥皂洗手，按規定穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。
(2)操作者動作要輕，必須在火焰周圍無菌區內打開瓶口，並將瓶口轉動燒灼。操作時盡量不要談話，若打噴嚏或咳嗽應轉向背面。
(3)操作時要常更換吸管，一旦發現吸管口接觸了手和其他污染物品應棄去。實驗完畢用消毒水浸泡的紗布擦檯面。
4、防止細胞交叉污染
在進行多種細胞培養操作時，所用器具要嚴格區分。
在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養瓶瓶口，以免把細胞帶到培養液中污染其他細胞。
細胞一旦購置或從別處引入，均應及早留種凍存，一旦發生污染可重新復甦培養。
5、無菌室的徹底消毒
1) 0.1%新潔爾滅全面徹底擦洗無菌室;
2)甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌，其水溶液和氣休對各種細菌、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用。
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