circRNA的高分文章到底做了些啥？

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作者：子非魚（轉載請註明：解螺旋·醫生科研助手）

近年來，非編碼RNA研究領域中百花齊放，精彩紛呈。circRNA作為該領域中的新寵自是當仁不讓，從NCBI有關於circRNA發表文獻來說，一直處於一個持續上升的趨勢（下圖1）。很多熱情高漲的小夥伴們都欲對其一探究竟，卻又苦於不知從何下手而著急萬分，那麼本文則幫助大家更快更好的在circRNA領域佔得一席之地。

circRNA的篩選及驗證

顯然，到目前為止，circRNA研究領域仍是一個充滿了潛力的大寶庫。每一個研究領域、研究方向都有發現新的circRNA功能的可能性。因而首先要從你的研究方向入手，找到屬於你的circRNA。一般通過高通量的檢測手段（晶元或測序），即可篩選到成百上千個在某種特定條件下與疾病特異性表達相關的circRNA。同樣，高通量篩選的circRNA驗證也是必不可少。

然而，circRNA的RT-PCR驗證有其特別之處。常規PCR引物只針對目的片段的上下游進行設計，而circRNA引物可分以下兩種方式設計：1）外顯子環化circRNA，需要特異性針對剪切位點處（backsplice junction site)來設計primer；2）內含子環化circRNA，可跨剪切位點設計，也可圍繞內含子區域設計引物。另外，circRNA引物設計建議還需要滿足擴增產物長度不超過100bp；且內參基因不能選用線性mRNA，可採用外參彌補。

qPCR線性RNA和環狀RNA設計原理及擴增產物圖

circRNA功能驗證

通常只要是你所在研究領域還沒有circRNA發表文章，那麼鑒定到與疾病表達相關特異性的circRNA，並稍加以驗證，1~3分的文章還是可以的。如果再想把文章檔次往上提一提，發表3-5分的文章的話，則需要用體內體外實驗去驗證circRNA的功能。

circRNA表達的組織特異性驗證

此時，可用原位雜交技術（Situ Hybridization）進行驗證。設計雜交探針時要跨backsplice junction位點，而後可很清楚的看到circRNA在哪些組織中表達很高，作為組織特性判斷的依據。

正向驗證——circRNA過表達

目前比較公認的成環機製為circRNA側翼序列的鹼基互補配對，稱之為Alu結構。基於此，可用PCR擴增含側翼Alu序列的目標DNA序列，而後依據相應限制性內切酶位點進行酶切，連接至pEGFP-C1載體中。將連接載體轉染相應細胞樣本，定量PCR檢測轉染效率。最後用divergent primer驗證circRNA過表達倍數。

過表達策略：1. 擴增目標區域包含circRNA側翼Alu序列或內部鹼基互補序列，側翼上下游1kb處過表達效率更佳；2. 目標區域擴增基於基因組DNA為模版。

反向驗證——circRNA沉默

沉默circRNA，可用siRNA沉默，即針對circRNA 的backsplice junction位點前後序列設計siRNA；而對於內含子環化circRNA，還可針對內含子區域設計相應siRNA。最後利用Divergent primer驗證circRNA敲除倍數。此外，每個siRNA設計相應的對照（backsplice junction位點一端互補配對，另一端錯配)。

circRNA機制研究

目前針對circRNA的功能機制研究不多，常見的調控基因表達和蛋白合成方式有：1）circRNA能與蛋白質/RNA結合,募集蛋白質複合體的組分或調控基因的表達；2)circRNA可以作為「sponge」海綿吸miRNA，調節靶基因；3）circRNA通過鹼基互補配對直接調控其他RNA水平。

一般來說，ceRNA調控機制是circRNA作用機制研究的首選，因而很多文章優先從ceRNA的角度去解釋其作用機理。而circRNA作為miRNA的「sponge」有兩個基本前提：1）circRNA和mRNA有共同的miRNA結合位點。2）circRNA影響其競爭結合對象mRNA的表達。

首先用RNA-FISH確認circRNA在細胞中的定位。細胞定位是決定調控機制研究方向的關鍵。轉錄後調控尤其是ceRNA調控，一般認為在細胞質中進行，如果該circRNA主要定位於細胞質，那麼是有可能成為ceRNA分子的。

其次，尋找靶定circRNA的miRNA及miRNA靶定的mRNA。1）利用生物信息學對其進行預測，即通過miRcode/starBase篩選circRNA潛在的miRNA結合位點（MRE），同時通過miRTarBase預測miRNA的靶基因。而後用通過熒光素酶報告系統及免疫共沉澱（RIP）進行驗證circRNA和mRNA之間的表達呈正相關性。2）也可直接通過circRNA+mRNA組合晶元高通量篩選，分析差異表達circRNA和mRNA之間的表達相關性分析，尋找與circRNA關係密切的mRNAs

最後，驗證circRNA對miRNA及其下游靶基因的表達影響。這部分可通過過表達和沉默circRNA中檢測mRNA的變化，過表達和沉默mRNA來檢測circRNA的變化以及circRNA和mRNA表達相關性分析加以驗證。

舉個栗子：

1）在細胞中轉染miRNA mimics，檢測circRNA和突變circRNA的靶基因表達變化。

2）在circRNA敲除細胞系，抑制miRNA的表達；或在circRNA過表達細胞系中，異位表達miRNA，檢測能否抵消掉circRNA異常表達引起的生物學變化。

3）構建含有靶基因mRNA 3』UTR區和突變序列的載體，檢測在circRNA敲降條件下是否會降低，加以在miRNA sponge的條件下，又是否能夠補救；或者在circRNA過表達下，mRNA表達是否會升高，加以miRNA過表達時又是否能夠補救。

如此將circRNA研究提升到作用機制的層次，後續在體內做些工作加以驗證的話，那麼，5分以上甚至10分以上的文章還是很有希望的。

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