「史上最悲壯論文」，班車司機與諾貝爾獎

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GFP的歷史告訴我們，科學和技術之間不能簡單地歸納為線性的單向關係，科學和技術之間有著非常複雜的動態作用過程。

GFP的歷史還告訴我們，在漫漫的科技歷史長河中，既有牛頓和愛因斯坦這樣燦若星辰照亮世界的天才人物，也有Prasher在黑暗中躑躅而行的寂寥身影。他們都是英雄。

水晶水母，學名為維多利亞多管發光水母

來源：Ecoxotic: Aquarium LED Lights, Reef LED Lighting

「科學有時很殘酷。對於Douglas Prasher來說，在賣車行打一份一小時掙10美元的工，與獲得諾貝爾獎及其帶來的榮耀和120萬美金，只有一線之差。」

——Dr. Marc Zimmer, 「Illuminating Disease: An Introduction to Green Fluorescent Proteins」

每年六、七月份，在美國西北太平洋海岸邊，都會出現成千上萬的水晶水母。它們直徑不超過10厘米，沒有頭，沒有有毒的觸角，全身都是透明的，在海水中搖曳著。當受到驚擾的時候，它們會在傘型身體的下緣發出一束束綠光。夏天一過它們又全都消失。日出日落，潮漲潮退，年復一年，周而復始，好像從遠古到永遠，都不會改變。

直到二十世紀六十年代初的一個夏天，幾個長桿撈網突然劃破海面的平靜，開始一網一網地捕撈水晶水母。

在此後的三十多年裡，水晶水母（學名叫維多利亞多管發光水母）的綠色螢光的奧秘被一點一點發現。

綠色螢光蛋白（GFP）的發現和應用成為生命科學革命性的里程碑， 而以GFP及其它熒光蛋白為基礎的現代分子成像技術成為生物醫藥科研的不可缺少的工具， 被譽為二十一世紀的顯微鏡。GFP的光輝照亮了世界的每個角落，徹底改變了人類對疾病的認知過程。

GFP的發現和普及過程跌宕起伏，涉及四個實驗室和六個關鍵人物，其中三人因此獲得諾貝爾化學獎。GFP的歷史在以前多有介紹，包括饒毅老師於2008年發表的博客[1]，其中描述最為翔實的是Marc Zimmer教授今年出版的新書[3]。綠色螢光蛋白的故事仍值得我們一遍又一遍地重溫和回味。

- 下村修的假說 -

那些長桿撈網的主人是在美工作的日裔學者下村修（Osamu Shimomura）和他的實驗室老闆Frank Johnson，及實驗室其他成員。

下村修出生於1928年，從小在日本和中國長大。當第二顆原子彈爆炸在長崎時，當時年僅16歲的下村修正在附近的軍工廠工作。他目睹了閃光和巨大的蘑菇狀煙雲。他在黑色的雨中跑回家，到家時身上的白襯衣已變成灰色。

下村修在1960年應邀並憑藉著福布萊特獎學金到美國普林斯頓大學做訪問學者。他先在普林斯頓大學工作22年，後又在伍茲霍爾海洋研究所做科研。他一直對生物發光感興趣。為什麼水晶水母可以發綠光是他孜孜不倦不舍不棄想要回答的問題。

在將近20年的時間裡，每年夏季他和家人從東海岸一路開車到西海岸，在華盛頓大學的「星期五港」實驗室外的棧橋上大批大批地捕撈水晶水母。回到實驗室，他又忙著把水母的傘蓋下緣切下來，不厭其煩地分離和分析各種成分。剪切，擠壓，過濾，攪拌，沉澱……

幾十次實驗和數萬隻水母之後，下村修終於弄清楚了綠色熒光的奧秘：

水母有兩個發光蛋白，第一個他命名為水母素（aequorin），是一個熒光素酶，在碰到鈣離子時會發出藍光[4]。第二個就是綠色熒光蛋白或GFP。水母素髮出的藍光作為能量會傳給GFP，激發出綠色熒光。但GFP的含量在水母中遠低於水母素，從水母中提取GFP更加耗時耗力。

下村修用來切水母傘體下緣的機器，由他當時的老闆Frank Johnson設計[2]。

水母素的發現導致了兩篇重要的論文發表[5, 6]。水母素被作為鈣離子的感測器注射到藤壺的肌肉細胞和烏賊的神經細胞里，當肌肉收縮時或是神經細胞放電時，科研人員第一次在細胞里清楚地看到了明亮的藍色閃光。

科學界意識到了發光蛋白的可能應用，但每一篇論文雖然只需要幾毫克的水母素，卻需要幾萬隻水母來提煉。這種昂貴的技術註定無法普及。

下村修當時只對水母素蛋白感興趣，而並不在意GFP。他提出了一個假說：GFP蛋白僅靠它自己不能發熒光，需要水母體內的酶加工才會變成熒光蛋白。

如果這個假說成立，GFP在生物科研中用處就不大了， 因為它在其它生物個體中無法獨立發光。但遺憾的是，該假說當時被普遍接受， 對以後GFP的研發有著深遠的負面影響。再加上GFP蛋白提取困難，在隨後的20多年裡，GFP的科研幾乎沒有任何進展。

- 史上最悲壯論文 -

故事中的第二個人物是比下村修小23歲的Douglas Prasher博士。Prasher在喬治亞大學的MiltonCormier實驗室作博士後時候，和其他成員成功地從水母中找到並克隆了水母素的基因，並用該基因在大腸桿菌了表達了水母素蛋白。

這是一個不小的成就。同從水母中提取蛋白相比，用細菌表達製備蛋白要方便、省時、省力和便宜得多，也人道得多。

任何實驗室想要用水母素作為鈣離子的感測器，都可以直接用細菌生產或以合理的價格購買。水母素的來源不再是一個瓶頸，直到今天它仍在實驗中被廣泛用來檢測鈣離子。

後來Prasher也在伍茲霍爾海洋研究所建立了自己的實驗室。他開始把目光投向了無人問津的GFP。他產生了一個獨特的想法，如果下村修的假說不成立呢？

也許GFP本身就能發熒光，並不需要水母的其它蛋白處理加工。如果這樣，GFP就可以通過基因拼接的方式被附著在任何蛋白的末端。而目標蛋白在活細胞內甚至是活的個體內的一切生理狀態下的活動都能被看得清清楚楚，就像時時刻刻有一盞探照燈照著它。

而那時候人們還沒有任何手段追蹤蛋白在活細胞或活體里的動態變化。驗證這一想法的第一步就是克隆GFP的基因。基因是蛋白的源程序。有了基因，後續工作就容易地多。

Prasher把自己的這些想法和計劃組織起來，作為科研基金的申請交了上去。但Prasher的假說與佔主導地位的理論背道而馳，因而他不斷碰壁，申請一次次的被拒絕。但功夫不負有心人，終於Prasher從美國癌症協會獲得了20萬美金的科研基金來支持這個項目。

從80年代初起，Prasher也開始一次次地在初夏前往西海岸「星期五港」實驗室，大批大批地撈水晶水母。但Prasher與下村修兩者的差異是，下村修感興趣的是蛋白，而Prasher搜尋的是GFP的基因。

由於在當時的條件下，很多現在普及的分子生物學的手段還沒有被發明，Prasher的工作量與下村修相比只多不少。

在將近3年的時間裡，Prasher先從約7萬隻水母中提取足夠的RNA建立水晶水母的基因庫（cDNA library），再用同位素標記的探針雜交的方法來大海撈針。一遍遍地嘗試，一遍遍地失敗，再嘗試，再失敗。直到他拿到了完整的GFP基因。他將GFP基因轉到了大腸桿菌里表達，又提取了GFP蛋白。

但殘酷的結果使他墜入了絕望的深淵：GFP並不能發綠熒光！看來下村修的理論是對的。他本來就有些動搖的自信心遭到致命一擊。

Prasher是一個孤獨的科學家，他不擅於和同行交流。

他和下村修在一個研究所共事多年，研究的課題緊密相關，但兩人只有一次談話的場合，還是在遠離研究所的一次會議上。在他苦悶的時候，在他的實驗走到瓶頸的時候，他無人可以傾訴，可以交流。這時候他的20萬科研基金已經用完了，再申請又被拒絕。他心灰意冷，徹底放棄了GFP。

在GFP發現和普及過程中的幾個關鍵人物。其中下村修，Chalfie和錢永健獲得2008年諾貝爾化學獎。

但在Prasher徹底告別GFP之前，他還是把克隆GFP基因的過程和結果寫成一篇論文，於1992年發表[7]。

在文中，他承認了GFP本身並不發熒光，下村修的理論是對的。這可能是歷史上最悲壯的一篇論文。在看似無邊的黑暗和疲倦中，Prasher不知道他與綠色的曙光有多麼接近。

Prasher的這篇論文引起了兩位同行的注意：哥倫比亞大學的生物學家Martin Chalfie和加州大學聖地亞哥分校的錢永健 （Roger Tsien）教授。兩個教授都發電子信件向Prasher索要GFP基因。Prasher毫不猶豫地無條件給兩個實驗室寄去了。

Prasher於1992年發表的「歷史上最悲壯的論文」。

Chalfie是研究線蟲的專家。線蟲約一毫米長，經常被用作模型來研究動物的發育過程和初級神經系統。它的一大優勢就是全身上下是透明的，這是驗證熒光蛋白標記技術最理想的動物模型。

Chalfie得到GFP的DNA後把它交給在實驗室里工作的研究生Ghia Euskirchen。Euskirchen發現Prasher的GFP基因並不齊整，在首尾各多了一些鹼基，因此它表達的蛋白並不是天然的GFP蛋白，而是抻長版的GFP，前後都有些多餘的氨基酸殘基。

原來Prasher在把GFP基因插到表達質粒上時，用了當時的通行方法，用兩個限制性內切酶切出來含有GFP基因的DNA片段，再接到質粒上。限制酶方法方便但不精確。

為了精確地把GFP基因插到表達質粒上，Euskirchen使用了剛發明不久還沒有普及的PCR技術。對於基因剪拼來說，限制酶方法是用斧頭砍，接縫的地方總是多一塊或少一塊，而PCR方法則是激光刀，可以把一個基因準確地切割下來，一個鹼基不多，一個鹼基不少。她把GFP基因嚴絲合縫地插入到質粒里。

令她大吃一驚的是，表達該質粒的細菌在培養的時候就是綠色的，在熒光顯微鏡下觀察竟然發出明亮的綠熒光。Euskirchen成為世界上第一個在大腸桿菌中看到GFP熒光的人。

至此下村修的理論被證明是錯誤的。GFP不需要其它酶加工。它的三個氨基酸構成光核或發色團，而蛋白的其餘部分摺疊成一個桶狀，將發色團圍在中間，就象一個有燈罩的檯燈一樣。而Prasher的GFP蛋白由於首尾多了一些氨基酸，在細菌中不能形成正確的桶狀構象，就發不了熒光。

Chalfie的團隊迅速地用GFP標記了線蟲的對接觸敏感的蛋白，觀察到它在線蟲體內神經細胞的表達。這一成果1994年發表在《科學》雜誌上[8]。Prasher由於提供了基因，被列為論文的最後作者。那期《科學》的封面就是一張在黑色的背景中發綠色熒光的線蟲的照片。

文章的發表引起了世界性的轟動。千千萬萬個學者為這張照片而痴迷。用GFP作為工具監測活的生物個體里的基因表達和蛋白變化為解決無數個生命不解之謎提供了鑰匙。

發表Chalfie論文的那期《科學》雜誌封面。

錢永健差不多同一時間得到Prasher的GFP基因，但卻沒有立刻開展這個項目。

錢永健是錢學森的表侄，在美國出生，16歲就獲得西屋科學獎。他是化學方面的專家，他的實驗室缺乏有生物背景的人。錢在等他剛招的生物博士後Roger Heim來做這個項目。在Heim還沒有加入錢的實驗室之前，錢永健就聽說了Chalfie的實驗室在GFP上取得的突破。他們決定另闢蹊徑，在酵母里表達了GFP。

另外他們以GFP為基礎，產生了一系列的突變蛋白，產生包括藍色，黃色和青色等不同顏色的熒光[9]。這樣在同一實驗中，兩或三個不同的蛋白可同時被跟蹤監測。

他們還在GFP蛋白里置換了一系列的氨基酸，大大提高了GFP的穩定性和發光強度。在今天生物醫學研究中大部分被使用的GFP都是錢的實驗室研製出的加強版GFP。

如果說Chalfie的那篇《科學》論文是向世界宣告一個工具的誕生，那錢的工作就是使這個工具更好用，更方便。洪水之門一下子被打開了，使用熒光蛋白技術的論文呈幾何級數增長。今天發表的生物醫藥領域科研成果有一半以上都用到這一技術。

2008年10月，瑞典皇家學院宣布諾貝爾化學獎將被授予對GFP的發現和應用有突出貢獻的三位科學家：下村修，Chalfie，和錢永健。而也起了關鍵作用的Prasher卻遺憾地與諾貝爾獎失之交臂。

更令人感慨的是，Prasher此時已不再從事與科學有關的工作。當記者找到他時，他正在阿拉巴馬州的一家豐田車車行打工，開班車接送客人，掙著最低工資。

原來在放棄了GFP項目不久，Prasher離開了伍茲霍爾海洋研究所，在阿拉巴馬州找到一份政府科研的工作。但不幸的是，由於政府撤銷了對該科研項目的投資，Prasher失去了這份工作。他又不想離開那個城市，但那裡的科研工作機會實在有限。為了養家糊口，Prasher無奈放棄了科學，找到了這份臨時工。

Chalfie和錢在記者採訪時和後來的諾貝爾獎演講時都強調了Prasher的關鍵作用。錢永健邀請並資助了Prasher一家去瑞典參加諾貝爾獎頒獎典禮。目前Prasher又重返科研，在錢的實驗室里工作。

通過Google Scholar檢索出的每年發表的提到GFP的論文數。

- 無論成敗都是英雄 -

GFP的故事令我感慨萬千。對這一段歷史，也許每個人得到的啟示都不一樣，可以探討的話題很多。

IQ和EQ與成功的關係；細節決定成敗的含義；每一個突破性成果的背後的研究生，博士後，和實驗員的貢獻；科學權威的理論對科學發展的影響；當代科研基金的評獎機制能否孕育出革命性的成果；運氣在科研中的作用（從80年代末起，每年夏天的水晶水母潮竟然神秘地消失了[2]）；對前沿技術（比如90年代初的PCR）的早期使用所獲得的巨大優勢……

但我今天只想談談兩個話題：科學與技術，貢獻和榮譽。

一個月前（10月23日）華爾街時報刊登了一篇隨筆，題目為「基礎科學之謎」[10]。作者Matt Ridley是資深的生物學家和暢銷書作者。

他在文中的主要觀點是縱觀人類歷史，技術的發展是複雜的，和科學的進步關係並不大。往往是新技術的出現才帶來了科學的突破，而不是像人們普遍認為的那樣，科學的發展引發了技術的革新。

文中指出，是先有了蒸汽機，才建立起熱動力學；先有了X射線晶體技術，才發現了DNA的雙螺旋結構。文章的一個推論是政府耗巨資支持基礎科研是沒有必要的。

我認為Ridley的觀點有些以偏概全。就拿生物醫藥來說，也許在早期，這種現象確實普遍存在：先發現了阿斯匹林，幾十年後其機理才逐漸浮出水面。

但在今天，從生物機理（科學）到確定葯靶再到新葯研發和使用（技術）是佔主導地位的模式，而GFP的歷史更是一個典型的例子。

下村修在一次又一次地提取水母中的發光蛋白時，他只想去解決生命的奧秘之一。但一旦GFP的機理被弄清楚了，GFP蛋白標記技術就水到渠成呼之欲出。Chalfie的論文完成了由科學到技術蛻變的第一步，而錢永健的實驗室和銷售加強版GFP基因的公司則完成了第二步：新興技術的成熟化和產業化。

再舉一個例子。PCR技術雖然是1983年問世的，但真正使其推廣的關鍵是能夠耐高溫的TaqDNA聚合酶。這種酶是在六、七十年代搞基礎研究的生物學家在探索黃石公園的溫泉中生長的細菌時發現的[11]。一個技術的誕生和成熟過程可能來源於幾十年來科學的積累：PCR技術誕生就是建立在DNA複製過程理論基礎上，而其推廣則離不開Taq酶的發現。

GFP的歷史還告訴我們，科學和技術之間不能簡單地歸納為線性的單向關係，科學和技術之間有著非常複雜的動態作用過程。由於GFP的發現（科學），才有了熒光蛋白標記技術，許多過去無法回答的生物問題才能迎刃而解（科學），包括許多疾病的分子機理，這又進一步促進了新葯的研發（技術）。科學產生技術，技術推動科學，科學再產生新的技術，如此循環反覆。

咱們再來談一下貢獻和榮譽。在今天，任何科研項目的成功都要依靠團隊的合作，而且這個趨勢只會愈演愈烈。據華爾街時報報道，擁有幾千個作者的論文也已不足為奇[12]。在這種時代的背景下，對任何一個科研成果來分析比較每位參與者的貢獻將會越來越困難。

在GFP的發現和推廣的過程中，下村修是開拓者，Prasher起到承前啟後的作用，Chalfie證實了自己的遠見，錢永健善於改進，而 Euskirchen和Heim擁有一流的實驗設計和執行能力。

要想從中挑出三個人授予諾貝爾獎是一個很艱難的抉擇。我相信諾貝爾獎評委是想努力做到公平的，他們為此認真調查了一年才做出的決定[3]。但由於每單項獎每年授予人數不能超過三個人，諾貝爾獎的評選結果註定有其不公平性。諾貝爾獎既是給個人的榮譽，更是對某個科研領域的肯定。

Prasher在GFP技術的發展中起到了關鍵作用，但功虧一簣，痛失諾貝爾獎。他在大眾的眼裡被媒體塑造成悲劇的角色。當我們在為他嘆息的時候，我們有沒有想到我們是可以改變這一結局的？

每一個做出貢獻的人都應該是我們的偶像，不管有沒有得到諾貝爾獎或其它榮譽。得到諾獎的人值得我們敬仰和歌頌，沒有得到的人更需要鮮花和喝彩。社會、媒介和政府都有責任，讓那些應該得諾獎而沒有得到的人享受同樣的榮耀和待遇。

從古至今，人類憑藉著自強不息的精神，對知識的好奇心，對真理的渴望，不斷推動科學和技術的交替進步，促進社會的發展。在漫漫的科技歷史長河中，既有牛頓和愛因斯坦這樣燦若星辰照亮世界的天才人物，也有Prasher在黑暗中躑躅而行的寂寥身影。他們都是英雄。

參考文獻：

1.饒毅: 美妙的生物熒光分子與好奇的生物化學家. 《科學時報》2008-10-06.科學網—美妙的生物熒光分子與好奇的生物化學家

2.Shimomura O: The discovery of aequorin and green fluorescent protein. Journal of microscopy 2005, 217(Pt 1):1-15.

3.Zimmer M: Illuminating disease : an introduction to green fluorescent proteins. Oxford ; New York: Oxford University Press; 2015.

4.Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y: Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. Journal of cellular and comparative physiology 1962, 59:223-239.

5.Baker PF, Hodgkin AL, Ridgway EB: Depolarization and calcium entry in squid giant axons. The Journal of physiology 1971, 218(3):709-755.

6.Ridgway EB, Ashley CC: Calcium transients in single muscle fibers. Biochemical and biophysical research communications 1967, 29(2):229-234.

7.Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG, Cormier MJ: Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 1992, 111(2):229-233.

8.Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC: Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 1994, 263(5148):802-805.

9.Heim R, Prasher DC, Tsien RY: Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1994, 91(26):12501-12504.

10.Ridley M: The Myth of Basic Science. The Wall Street Journal 2015.

11.Chien A, Edgar DB, Trela JM: Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. Journal of bacteriology 1976, 127(3):1550-1557.

12.Hotz RL: How Many Scientists Does It Take to Write a Paper? Apparently, Thousands. The Wall Street Journal 2015.