曾與諾獎失之交臂、人小鬼大的miRNA如何改變細胞命運？

編者按：

俗話說，到什麼山唱什麼歌，事物都會隨著位置環境的改變而變化。1993年，美國科學家維克托·安博斯在線蟲中發現了第一個miRNA，他的驚人發現不僅掀起了如今已蔚然大觀的miRNA研究熱潮，也同時為miRNA的研究定下了一條「鐵律」，即miRNA通過結合3』UTR在細胞漿中抑制基因的表達，否則就難以講述一個完美的故事而難成主流。但復旦大學生物醫學研究院於文強課題組發現，與細胞漿的miRNA作用相反，細胞核內miRNA（NamiRNA， Nuclear Activating miRNA）主要發揮系統性的基因激活作用，胞核和胞漿位置的變化使miRNA成功實現角色轉換。本專欄由復旦大學教授於文強組織策劃，邀請了國內外表觀遺傳學領域學者共同完成，希望通過本專欄讓公眾更好地了解表觀遺傳領域近年的發展概況以及它是如何解釋我們日常有意思的生命現象。

撰文 | 梁英 (復旦大學生物醫學研究院博士生)

責編 | 葉水送

每個女孩內心深處都渴望青春永駐，擁有嬰兒般吹彈可破的細膩肌膚，可是無奈歲月的刻刀，毫不留情在臉上留下深深淺淺的印痕，皺紋一來便是排山倒海，不可思量，這如同夢魘般的事實，簡直讓人輾轉反側，夜不成寐。精明的商家窺探到這一秘密，於是向愛美人士大力鼓吹護膚神器，有些產品就應用了miRNA與肌膚衰老相關的原理，他們比較了年輕肌膚與衰老肌膚中的miRNA，篩選出與調控皮膚蛋白息息相關的三條miRNA：miR-29，miR-34， miR-203。從天然產物中分離出抑制這三條miRNA的成分，進而起到抗老化、增強皮膚彈性、減輕皺紋的一系列效果。其真正的作用機制和作用效果應該是有待時間的檢驗。為了愛美，很多人甘當小白鼠。

不過，這也說明人類從基因層面以及表觀遺傳角度，有可能創造與時間抗衡的辦法，miRNA的發現恰與皮膚相關。研究者在做實驗時發現在線蟲中突變不同基因片段，幼年線蟲的柔嫩皮膚變的又老又皺，而老年線蟲的皮膚竟然變得又嫩又軟。接下來，讓我們來追溯一下這個在人體龐大基因組中僅有約21個鹼基的單鏈片段的歷史。

人小鬼大的miRNA，曾與諾獎失之交臂

miRNA的發現，與一位祖籍波蘭的生物學家維克托·安博斯（Victor Ambros）的工作有關——他在線蟲中發現了第一個miRNA lin-4。

上個世紀50年代，安博斯出生於美國東北部新罕布希爾州，從小受其父親的影響，他喜愛閱讀及動手製作一切他認為新奇的小玩意兒。上世紀60年代，美國阿波羅飛船登月成功，如同那個年代的很多年輕人一樣，安博斯也想成為一名宇航員，直到1971年他進入麻省理工學院學習天文知識時，發現自己的物理算術能力一般。睡在他旁邊的室友好幾個晚上與他深夜討論分子生物與基因組學，於是他把興趣愛好又轉接到了分子生物科學，繼而在博士期間師從諾貝爾獎獲得者戴維·巴爾的摩（David Baltimore），從事線蟲相關的研究。

時光飛逝。1993年，安博斯在哈佛大學成立了自己的實驗室，他發現突變lin-4的成年線蟲，長出幼嫩的皮膚，而突變掉lin-14的幼年線蟲，則會長出皺皺的皮膚，原因竟是在線蟲中lin-4可調控lin-14並抑制它的表達。Lin-14蛋白在幼年線蟲中大量富集，而在成年線蟲大量減少。所以突變掉lin-4後，lin-14會增加， Lin-14蛋白的大量富集會使得成年線蟲長出幼嫩皮膚。

安博斯早期以為lin-4是某種蛋白質，結果這種具有調控功能的分子竟是一種只有21個鹼基的RNA分子，這讓安博斯感到非常意外。該研究最終發表在鼎鼎有名的Cell雜誌上。可以說安博斯當時的發現，開拓了科學家們對細胞內非編碼RNA，也就是不參與編碼蛋白質的RNA生物學功能的認識。然而該發現的前瞻性，並未引起很多科學家的重視，因為miRNA在當時被認為不具有普遍的調控意義，很多問題難以被解釋，或許連安博斯本人也認為miRNAlin-4對lin-14的調控只是個例，因此也未對此進一步研究。此後一段時間miRNA的相關研究基本處於停滯狀態。直到2000年，第二個miRNAlet-7被發現，人們終於開始意識到miRNA對基因調控具有普遍意義。

Victor Ambros

轉眼到了2006年，當年的諾貝爾生理或醫學獎頒給了安德魯·法爾（Andrew Fire）和克雷格·梅洛（Craig Mello），以表彰他們在RNAi（RNA干擾，指某些雙鏈小RNA能夠沉默基因表達的現象，這一類小RNA也被稱作siRNA）領域做出的貢獻。但許多人認為，首次發現miRNA的安博斯同樣應該在諾貝爾獎的歷史上留下名字。由於諾貝爾獎評選委員會很少會針對同一個領域重複頒獎，所以儘管安博斯曾一度被提名諾貝爾生理或醫學獎，卻最終失之交臂。如果當時安博斯繼續堅持對miRNA進行研究，是不是少留一份遺憾呢？

多年之後，我們不得不承認，無論是法爾和梅洛，還是發現首個miRNA的安博斯，他們都對錶觀遺傳學的研究開闢了新方向。表觀遺傳包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA等研究，RNAi和miRNA的研究都屬於非編碼RNA的範疇。

秀麗隱感線蟲中lin-4調控lin-14的表達

簡單來說，生物體內的RNA可分為兩種：一種是可編碼的，即參與編碼蛋白質——遺傳物質DNA轉錄生成mRNA（mRNA，也就是信使RNA，由DNA轉錄而來，能進一步翻譯蛋白質），信使RNA進一步翻譯生成蛋白質；另一種是不能編碼的，即非編碼RNA。miRNA正是後面這種非編碼RNA中的一種，由於它的長度很短，僅有21-23個核苷酸組成，因此稱作miRNA。

從發現第一個miRNA到現在已有20多個年頭，miRNA的研究目前可謂是進入了井噴時代。根據miRBase的數據統計顯示，當前已發現的人類miRNA前體有1881條，成熟miRNA有2588條。隨著miRNA 相關研究不斷推進，miRNA在腫瘤發生髮展過程中的重要作用也不斷地被揭示出來，腫瘤細胞十大特徵的維持，均有miRNA參與。腫瘤細胞中存在miRNA 的異常高表達，這些高表達的miRNAs 通過靶向基因3』UTR 區域，干擾靶基因，尤其是腫瘤抑制基因的正常表達，導致正常細胞獲得了癌細胞的生物學特性。

miRNA是非編碼RNA的一種

miRNA研究中的選擇性無視現象

可以說，miRNA的作用是「Working anytime anywhere」，對它的研究也呈現出白熱化的狀態。不管是什麼研究方向，科研工作者紛紛擠入miRNA研究之門。但是，我們也應該看到，近幾年，miRNA的研究由於其思路單一化、缺乏創新性而有慢慢變冷的趨勢。正如魯迅先生說：這世間其實地上本沒有路，走的人多了，也便成了路。可是，走的人太多，就成了套路。miRNA研究的人越來越多，創新卻越來越少。

幾乎所有的研究都認為miRNA在細胞漿中通過結合靶基因3』UTR抑制翻譯或降解mRNA，如果信使RNA被降解，那麼對應的蛋白質不能被翻譯，可能造成相應的生理功能障礙，進而發揮負向調控作用，抑制靶基因表達。事實上，大部分這類研究常常淪為了典型的「馬後炮」（miRNA對已經存在的基因發揮抑制作用，而很少從根本上調控基因的轉錄）。然而當miRNA作用於細胞時，基因晶元檢測總是會發現一些基因下調，也有一些基因上調。受以往的「抑制理論」影響，我們總是在下調的基因中尋找miRNA的靶基因，即使在上調基因中勉強找到某個基因與這個miRNA功能相關，我們還是必須找到這個基因的 「Repressor」（抑制子，抑制靶基因表達的基因片段），然後通過「Repress Repressor」來講述一個「完整」的miRNA故事。這樣miRNA上調基因的相關研究則被「選擇性無視」（selectively neglected）。

miRNA抑制翻譯或降解mRNA的負向調控機制

與此同時，通過對定位於細胞核和細胞漿的miRNA測序，許多miRNAs存在於細胞核中（要知道，以往對於miRNA的研究大都是默認在細胞漿中），後續研究也證實這些miRNA定位於細胞核中，但其功能並不清楚。

是不是這些定位於細胞核內的miRNA在基因的表達調控過程中發揮著重要作用呢？如果miRNA負向調控機制不能完全解釋所有的調控現象，有沒有新的理論來補充並撐起未來miRNA研究的一片藍天？在紛擾繁雜的科研熱點中， miRNA研究要怎樣站住腳，它的出路在哪裡呢？

一身二任：除了抑制，還能激活

科學的發展總伴隨兩面性。那些「跟風式」的研究可能暫時存在於科研的舞台，但是遲早會淹沒於歷史的汪洋中。除了miRNA負向調控，有些個案報道在特殊情況下miRNA能夠促進基因表達或翻譯，但其確切的作用機制還不夠明確。遺憾的是，目前為止人類的2588條成熟的miRNA，尤其是新近發現的miRNA，大部分功能都聚焦在miRNA的負向調控的作用機制上，對任何一個miRNA的功能研究，幾乎都是千篇一律地找到對應的靶基因，並對其負向調控的作用機制進行闡述，進而與腫瘤控制與靶向治療相關聯。

隨著人類基因組計劃的順利完成，我們已開始迎接後基因組時代的到來。ENCODE 作為後基因組時代重要的發展計劃，很多研究表明miRNA 定位於細胞核中，雖然其功能並不清楚，但天生我材必有用，我們相信這些定位於細胞核內的miRNA 在基因的表達調控過程中一定發揮著某種重要作用，而且這些miRNA 所發揮的功能應該不同於傳統的細胞漿miRNA。

另一方面，一些定位於核內的miRNA是具有組織特異性的，也就是說，特定的miRNA在一些特定的組織中高度富集而在其他組織中低表達甚至不表達。比如，miR-1在肌肉組織中高表達，miR-124在中樞神經系統中特異性表達。有意思的是，增強子（enhancer），這種能強化轉錄的DNA序列片段，也具有組織特異性，比如之前朋友圈裡流傳甚廣的「蛇為什麼沒有腳？」的故事中（簡單來說就是敲除小鼠染色體上的增強子序列ZRS，小鼠不會長出四肢，而給敲除ZRS後的小鼠重新補上缺失的序列，小鼠又會長出四肢），決定四肢的增強子ZRS會高度富集在四肢中來維持四肢的正常發育發展。那麼，具有組織特異性的核內miRNA是不是與增強子有關聯呢？如果有，核內miRNA又是怎樣與增強子相互協調，決定組織細胞的特異性？

缺失增強子ZRS的小鼠長不出四肢，而把缺失的ZRS片段補上，小鼠長出了四肢，圖片來自Kvon et al., 2016.

有意思的是，復旦大學生物醫學研究院於文強課題組近期的研究工作發現，許多miRNA自身在基因組的位置與增強子區域高度重合，如hsa-miR-26a-1、hsa-miR-3179和hsa-miR-24-1等。這些miRNA大多能定位於細胞核內。進一步研究發現，這些miRNA能夠與增強子結合，並在全基因組的水平上激活基因表達。

進一步研究發現，miRNA的這種特性並非是個例，而是適用於很多組織和細胞。在研究miRNA自身的表觀遺傳學調控機制時，我們在7種不同的組織細胞中，對1594條miRNA前體進行了系統分析，意外地發現有300多條miRNA前體在基因組中的位置與增強子的組蛋白修飾標誌H3K4me1或H3K27ac高度重疊，這讓我們將同時具有組織細胞特異性的miRNA和增強子這兩個重要的分子生物學事件聯繫起來。我們發現，這些核內miRNA的激活作用依賴於增強子的完整性，如果敲除增強子所在位點的某段序列，miRNA便不能發揮上調作用，同時腫瘤細胞的增殖與遷移能力都受到影響。

miRNA所在的基因組位置與增強子區域的重疊分析（圖中H3K4me1和H3K27Ac為增強子表觀遺傳修飾標記）

基於此，我們認為：miRNA是重要的雙功能分子。當miRNA位於細胞漿時，它可以作用於mRNA 3』UTR區域，如同滅火器一樣，阻斷mRNA的翻譯進而發揮基因的負調控作用；與此相反的是，當它位於細胞核中時，就像一個點火器，通過結合增強子改變增強子的染色質狀態，從而激活基因的轉錄表達。

miRNA在胞漿與胞核中的雙向性功能

我們把定位於核內並有激活作用的RNA稱為NamiRNA（Nuclear activating miRNA）。基於此，我們提出了NamiRNA-增強子-靶基因網路激活模型，用於揭示細胞核內miRNA功能。這一激活模型能解釋很多之前研究中不能解釋甚至被刻意忽略的研究現象（比如腫瘤細胞中除了下調基因，上調基因怎麼解釋）。

令人驚喜的是，NamiRNA與靶基因存在直接的正向調控關係，它還參與腫瘤細胞的增殖、遷移與侵襲等生物學行為。雖然NamiRNA現在剛起步，踽踽獨行難免寂寥，但未來如果能深入探討研究，NamiRNA的正向調控理論無疑會幫助解釋更多的生物學現象，應用於更多的研究領域，為腫瘤的臨床診斷和治療提供新的線索和策略。