郭一然：罕見單基因病的NGS數據分析與變異解讀

編者按:

在2017年2月28日——第十屆國際罕見病日到來之際，罕見病發展中心（CORD）作為國際罕見病日中國區官方合作夥伴，特別推出罕見病日專稿系列。這些文章的作者有醫學專家、醫藥企業負責人、基因檢測公司、患者組織等利益相關方，通過這些專家老師各自獨特的視角，帶我們走進「罕見的世界」。今天，為大家帶來的是美國費城兒童醫院研究科學家郭一然老師的文章。

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郭一然，費城兒童醫院研究科學家，資深人類遺傳學、醫學遺傳學及生物信息分析專家，攻讀博士期間曾以主要成員或負責人的身份參與了多個基因組課題，包括炎黃一號、蠶類基因組、大熊貓基因組及丹麥200人外顯子項目等。在費城兒童醫院應用基因組學中心接受博士後培訓期間，主要工作是獨立開發基於海量樣本的遺傳關聯分析流程，在此基礎上對人類複雜性狀與疾病進行研究，鑒定出多個顯著相關基因。隨後作為的助理研究員以及研究科學家，主要負責「千種罕見遺傳疾病測序計劃」，並鑒定ACD、MRPS7、TUBB4A等多個與罕見單基因病相關的新基因，發表文章50餘篇。獲得多項獎勵，包括Davis基金會16萬5千美元資助，進行神經性厭食症的遺傳學研究。

5年前的我從未意識到，科研與臨床間的區別竟然如此之大；5年的從業經驗也讓我體會到，至少在罕見病診斷領域，科研與臨床間的鴻溝在快速縮小。罕見病給科研與臨床的碰撞創造了絕佳的機會，各領域專家彙集到一起經常迸發出思想的火花。我從博士研究生階段開始進行基因組學、遺傳學和生物信息學科研工作，10年間逐漸形成了自己的思維框架與工作模式。

近幾年與臨床醫生溝通後，我對臨床工作的初步印象是，它最接近患者的現實世界，需要嚴格遵循專家共識與操作規範，並把安全性、可靠性與及時性放在最重要的位置。生命科學研究則著重探索與創新，並且隨著近些年相關學科的發展，也越來越鼓勵跳出已有框架：「跨界」。再者，科研的時效性雖然較強，但某些項目由於種種原因可能會需要不停地排錯，戰線拉的比較長，還可能需要返工----把之前幾天、幾周甚至幾個月的結果推翻，重新來過。

以罕見病的遺傳診斷為例，一方面，我們很可能需要藉助科研領域最新的理論與技術開展工作，因為隨著檢測技術的快速迭代，每個月都有新的致病基因被鑒定出來，而且OMIM6（在線人類孟德爾遺傳資料庫）更是每天都有更新。另一方面，這些科研發現是否具有廣泛的、可靠的臨床意義，是醫生們、也是患者們最關心的問題。

2015年初的時候，在工作中比較困擾我的一個問題是，大部分罕見病家系都較小（當然，再小的家系也比單一患者的「孤例」容易分析），而且通過全外顯子組測序（WES）、對照某個基因-疾病資料庫（如HGMD7目前最新的2016年第4季度專業版）後，如果已知致病基因內未發現突變，那麼該家系就有可能會成為暫時的「懸案」：即明明強烈懷疑這是罕見單基因病，但我們就是無法找到致病基因突變。

對這種家系，根據一系列規則與條件，例如由計算變異特徵得出、根據生物學功能實驗推斷、以及藉助群體遺傳學頻率信息估計，通常情況下我們能找出一個候選遺傳變異列表，即致病突變有可能存在於這個列表中。接下來如何確定這個列表中的每個變異是否具有致病性8、是否可以導致該疾病，就成為很棘手的問題：我們可以查閱文獻推測基因功能及其與疾病的關聯關係，但出於成本考慮，無論是干實驗（如蛋白質突變的計算機模擬）還是濕實驗（體外模型、模式生物等等生物學功能表徵）都不可能立刻展開。

2015年3月，我正好參加了美國醫學遺傳學與基因組學會ACMG9在美國猶他州鹽湖城舉辦的年度臨床遺傳學大會10（AMCG），其中一個報告吸引了我的注意：貝勒-霍普金斯孟德爾基因組學中心建立的GeneMatcher11（基因配對網），致力於鏈接全世界對相同基因感興趣的臨床醫生與科研人員。

GeneMatcher的一種最簡化應用是，將上文說到的基因列表全部輸入，如果此前也有人輸入過相同的一個或幾個基因，那麼GeneMatcher就會通過電子郵件告訴我對方的聯繫信息，便於彼此合作。這個功能看似簡單但卻可以解決許多實際問題，特別是當某個科研實驗室專門研究某種基因/蛋白的功能但缺乏臨床數據支持，而某個醫生在病人的基因組數據里發現了這個基因上的變異但缺乏對其功能的了解時，GeneMatcher就可以將此二者真正地鏈接起來。

這無論對罕見病的診斷、對科研成果的發表、還是對後期潛在治療方法或藥物的開發都具有十分重要的意義。另外一種情況是，多個實驗室同時在某種罕見病中發現了某個基因或某些彼此相關基因里的變異，大家可以通過GeneMatcher彙集病例，從而提高研究結果的可信度與文章發表的可能性及影響力。

此後出現的Matchmaker Exchange12更是將GeneMatcher及全球另外6個具有相似功能的資料庫全部納入其中（稱為「會員組織」），並部分採用7個額外資料庫的內容（稱為「參與單位」），形成可以互相訪問的網路並實現數據共享。

圖片來自http://www.matchmakerexchange.org/

在本職工作之餘，近兩年我還參與了一些中國的罕見病相關工作。2015年底，隨著媒體上圍繞「林林」病情所展開的討論13，罕見病逐漸進入公眾視野，我也有幸參與了部分數據分析工作。幾乎同時，由多方聚力、北京中日友好醫院顧衛紅教授擔任總協調人的「中文人類表型標準用語聯盟」CHPO14成立。HPO旨在為人類疾病中出現的表型異常提供標準化的辭彙表，並為今後的精準醫學及基因診斷的智能化、自動化奠定基礎15。

作為HPO中文化版本的CHPO則對中國的罕見病事業及精準醫療戰略都具有非凡的意義，而我也有幸在CHPO項目中負責翻譯一部分頭或頸部的異常。2016年底，「遺傳診斷大師」微信群成立，我先加入其中，後來成為群主。該群由全國各地乃至全世界的遺傳學、醫學專業人士組成，旨在交流遺傳診斷、遺傳諮詢以及臨床遺傳學方面的信息與業界最新進展，並經常有專業的罕見病、遺傳病病例討論，以及會議、報告的實時直播。

下面，結合最近幾年的體會，我打算提出幾個與罕見病相關的議題，供大家思考、探討。

1. 罕見病、單基因病、孟德爾病、罕見單基因病、遺傳病。

這幾個概念之間既有聯繫，又有區別；經常替換使用，又容易造成混淆。罕見病，顧名思義，在人群中應該不常見。但究竟罕見到什麼程度，各國、各機構定義不同16。單基因病則通常由單個基因中的突變導致（染色體畸變是否屬於此類疾病？）。孟德爾病，遵從等位基因分離的孟德爾遺傳規律的疾病（也包括CNV、結構變異、乃至染色體畸變）。罕見單基因病，既罕見，又由單個基因的突變導致（是否存在罕見的多基因/多因素疾病？是否存在常見的單基因病？）。遺傳病，即遺傳因素在致病機理中佔據主導地位（二型糖尿病、心腦血管疾病等家族聚集性較強的複雜常見病算不算遺傳病？）線粒體疾病、受到遺傳印記和動態突變影響的疾病又該如何歸類？

2. 基因檢測技術的現狀以及未來發展。

基因檢測極大地推動了罕見病的準確診斷。而在基因檢測的上游，從一代測序（Sanger），二代測序（NGS17），到三代測序（以PacBio為代表18），再到四代測序（納米孔等），我們在最近40年中經歷了世界科技史上屈指可數的超摩爾定律發展階段。DNA序列的讀取越來越快、越來越准，所需成本也越來越低：華大發布BGI SEQ19，Illumina發布NovaSeq20，PacBio發布Sequel21，Oxford Nanopore/MiniIon22便攜測序儀等蓄勢待發就是明證。然而，至少在目前，Sanger方法仍然是驗證基因組變異的金標準，而基因晶元/微陣列等「傳統」技術也仍然在基因檢測領域佔有一席之地。二代、三代甚至四代的高解析度技術是否會在未來取代這些傳統技術？將新技術推廣到臨床應用會面對哪些挑戰？

3. 數據分析與變異解讀。

伴隨高解析度基因檢測新技術而來的，是數據分析與變異解讀方面的新情況，機遇與挑戰並存。測序產生的海量基因組數據已經使得不少臨床醫生望而卻步，基因組變異的致病性確認也越來越需要邀請專業「遺傳解讀師」的參與。最近，由世界最大出版社「施普林格-自然」出版、上海復旦大學王向東教授等主編的新書《臨床生物信息學應用》23就在這方面有詳細闡述。在全世界範圍內，目前基於WES的罕見單基因病遺傳診斷率總體上不超過40%，即一半多的病例仍屬於「懸案」。另有研究指出，定期對這些懸案進行重新分析，可以將診斷率提高10個百分點24。

可以想見，隨著基因組測序數據的積累以及生物學功能研究的發展，越來越多的基因被賦予生理/病理功能，而這些基因中的變異也就越來越多地與特定疾病聯繫起來。既然如此，那麼患者/消費者及醫療機構以外的第三方檢測機構是否可以推出這樣的服務，對已經測序但暫時沒有定論的病例，特別是帶有致病性不明的突變（VOUS）的病例，承諾提供有限或無限的更新解讀？這裡面存在很多需要考慮的問題，比如遺傳診斷具有時效性（經由產前診斷髮現的嚴重遺傳病很可能會導致人為的妊娠終止）。

再比如，某些報道出來的科研進展並不一定可靠，而根據不可靠的文獻進行遺傳諮詢、變異解讀則是很危險的。我們可以考慮這樣的情況，發表文章時（通常是大規模測序計劃開始以前的上世紀90年代或更早）作者在某種疾病D中發現了某個基因變異V，並且在某個控制組C（健康人群）中沒有發現該變異，於是將V報道為與D相關或導致D發生。然而在近幾年才建立起的大規模基因組資料庫（如ExAC25/gnomAD26）中搜索後我們發現，V在某地區，如東亞國家的普通人群中的頻率（如0.1%）顯著高於D的發病率（如0.001%），因此V很可能不是導致D的變異。

究其原因，有可能是當時的控制組C樣本量不夠（目前的ExAC已經達到6萬人級別），也有可能是實驗條件不足所導致的「假陽性」，即報道中的患者並不攜帶變異V。另一種科研報道不可靠的來源是，文獻出版界於21世紀初興起的開放獲取27（open access）潮流在客觀上催生出一些低質量科學、醫學期刊，閱讀文獻的時候一定要仔細甄別。

在不遠的未來，生命科學大數據（基因組、基因表達及轉錄組、表觀基因組、代謝組、宏基因組及微生物組、蛋白質組等）、人工智慧/統計學習（經由大規模數據共享而實現；從簡單的分類器到類似阿爾法狗、IBM Watson的深度學習）、電子醫療/健康檔案（表型規範化，HPO/CHPO等）、生物醫藥背景知識等都將有機聚合，形成真正的個體化精準醫學（Alphabet、微軟、蘋果、阿里、百度、騰訊等IT巨頭都不約而同地瞄準了這個領域，其中也包括中國的碳雲智能）。

2017年2月2日的《自然》雜誌更是刊登了美國斯坦福大學研究人員撰寫的一篇論文，我個人認為標題可以翻譯為「深度神經網路在皮膚癌分類方面已經達到皮膚病專家的水平」28。人工智慧的表現擁有足夠多的數據以後，人工智慧最終是否可以取代病理師，甚至取代醫生？具體到罕見病基因診斷方面，計算機最終是否能夠取代遺傳診斷師？

4. 新技術的作用階段：婚前、孕前、著床前、產前、新生兒。

近年來生物醫學領域的新技術層出不窮，對罕見病而言，中國的華大基因、貝瑞和康、嘉寶仁和、百邁客等機構已經逐步在實現：在婚前和孕前為患者或家屬提供諮詢、制定方案、評估風險；著床前（PGS/PGD及輔助生殖技術）和產前（NIPT等非侵入性技術）對遺傳病提供更有效地監控；新生兒階段的篩查則為早檢測、早發現、早治療提供可能，也為以後的疾病管理提供分子遺傳學基礎。在其中的某個階段，在生物醫學倫理規範的框架下，是否可以使用基因編輯（CRISPR）手段人為地降低罕見病的發病可能性？（2017年2月14日，美國國家科學院NAS與美國國家醫學院NAM聯合撰寫報告，允許在嚴格的監管下對嚴重疾病患者的生殖系細胞或早期胚胎細胞利用基因編輯手段開展臨床試驗29）

5. 罕見病在世界，罕見病在中國。

在日常工作中以及罕見病相關的微信群里，我經常能體會到這個領域的國際交流愈發頻繁，特別是經過類似GeneMatcher11的配對，世界各地的研究人員和臨床醫生能夠站在相同的平台上進行合作。OMIM6、HGMD7、GeneReviews30等基因-疾病關聯資料庫、美國紐約哥倫比亞大學教授/北京希望組首席科學家王凱博士及團隊31編寫的AnnoVar32/Phenolyzer33/InterVar34等遺傳變異分析軟體等也是全世界通用。

同時，在罕見病方面，中國也有自己的國情。在以中國國家罕見病註冊系統35為代表的政府動議項目、以中國罕見病發展中心1為代表的罕見病公益團體與病友組織、以北京協和醫學院黃尚志教授為代表的醫學遺傳學臨床與科研精英們、以華大基因下屬分支和眾多「華創」為代表的第三方臨床檢驗機構，以及廣大醫務工作者的共同努力下，社會公眾已經對罕見病不再陌生。如何進一步推動罕見病科學普及，如何構建當前形勢下的遺傳諮詢培訓體系，如何完善罕見病倫理規範並實現立法36，如果規範基因檢測和遺傳診斷市場，如何建立中國人特有的遺傳變異譜（囊獲儘可能多的中國人基因組數據37，類似於ExAC25/gnomAD26），如何更高效地引進孤兒葯，如何設計與罕見病相關的醫療保障制度等等，都是值得深入研究的問題。

在罕見病、遺傳病事業方面，中國更具有獨特的優勢。中國經濟水平的快速提升，使得近年來基因檢測及相關領域倍受資本青睞。在人才方面，中國有本土培養的醫學遺傳學專家學者、留學歸來報效祖國的精英、還有藉助國家資助被派往全球的優秀中青年訪問學者群體。中國人口基數大、罕見病例多，這也為醫學遺傳學科研提供了寶貴的樣本資源。

幾個小時前我觀看了在蘇州舉行的中國遺傳學會遺傳諮詢分會2017年會的微信視頻直播，其中包含許多罕見病事業相關的內容。包括中國科學院院士、上海交通大學賀林教授、美國辛辛那提兒童醫院黃濤生教授、美國哈佛大學沈亦平教授在內的多位大咖進行了精彩的演講與討論。

賀林院士提到利用互聯網/移動端平台等操作模式進行遺傳變異解讀交流/交易，以及「中國優先」。在罕見病和醫學遺傳學方面，中國過去落後於世界先進水平，隨後奮起直追，並通過舉辦遺傳諮詢短期培訓班、漢化英語資源（CHPO14、ACMG變異解讀指南8、GeneReviews30等）的過程快速提升了相關人員的整體水平。希望在不久的將來，中國能參與相關國際通用標準的制定、國際通用資料庫的共管38，最終建立自己的標準、指南、體系、資料庫，並推廣到全球。

本領域發展速度過快，每天都有新的動向，因此本文也是幾經修改、爭取能夠包含盡量多的最新內容。雖然如此，以上仍只是我的一家之言，難免偏頗。歡迎大家批評指正，謝謝！

注釋及參考文獻（所有網頁均在2017年2月18日訪問可用）

1.http://www.hanjianbing.org/（中國罕見病發展中心官方網站）

2.http://www.chop.edu/（美國費城兒童醫院官方網站）

3.http://caglab.org/（美國費城兒童醫院應用基因組學中心官方網站）

4.http://www.research.chop.edu/chop-research-institute-publications/press-releases/childrens-hospital-philadelphia-and-bgi-announce

5.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/myncbi/1Fa6eeFrrmf/bibliography/41433298/public/?sort=date&direction=descending（PubMed上我個人的發表文章列表）

6.http://omim.org/（由美國約翰·霍普金斯大學運營的在線人類孟德爾遺傳資料庫，包括權威的基因-單基因疾病聯繫信息，每日更新）

7.http://www.hgmd.org/（生命科學公司Qiagen旗下、由英國Cardiff大學維護的人類遺傳疾病基因突變資料庫，每季度更新）

8. 2015年，美國醫學遺傳學與基因組學會ACMG聯合分子病理學會AMP在GeneticsIn Medicine上專門發表了基因組序列變異的解讀標準與指南，免費全文見http://www.nature.com/gim/journal/v17/n5/full/gim201530a.html；中國解放軍總醫院王秋菊教授團隊等也已經獲得原版授權，並且目前已經接近完成中文版的翻譯工作，具體見http://acmg.cbgc.org.cn/。關於基因組序列變異的解讀，此處可以展開成一篇獨立的文章

9.http://www.acmg.net/（美國醫學遺傳學與基因組學的行業協會）

10.http://ww4.aievolution.com/acm1501/index.cfm?do=cnt.page&pg=1018

11.http://genematcher.org/

12.http://www.matchmakerexchange.org/

13.http://www.229andme.com/article/719

14.http://www.chinahpo.org/；在非英語國家裡，中國是第一個100%完成HPO翻譯工作的國家

15.http://human-phenotype-ontology.github.io/

16.美國在2002年通過的罕見病法案中將罕見病定義為美國總人口中患病人數少於20萬人，或每1500人中患病者不超過1人的疾病http://www.gpo.gov/fdsys/pkg/PLAW-107publ280/html/PLAW-107publ280.htm；歐盟則在2004年將罕見病定義為每1萬人中不超過5人罹患且威脅生命或慢性致殘的疾病http://ec.europa.eu/health/ph_information/documents/ev20040705_rd05_en.pdf據筆者所知，到目前為止中國尚未對罕見病進行官方定義，但在2016年9月23日的「2016年第五屆中國罕見病高峰論壇」上，罕見病發展中心（CORD）主任黃如方先生作為主辦方代表在開幕式上正式發布《中國罕見病參考名錄》，其中包括147種罕見病http://www.hanjianbing.org/content/details_12_3240.html

17.http://www.seq500.com/portal/hot/ngs.shtml

18.http://www.grandomics.com/blog/?id=29

19.http://www.genomeweb.com/sequencing/bgi-launches-new-desktop-sequencer-china-registers-larger-version-cfda

20.http://www.genomeweb.com/sequencing/illumina-unveils-new-high-throughput-sequencing-instrument-jp-morgan

21.http://www.genomeweb.com/business-news/pacbio-launches-higher-throughput-lower-cost-single-molecule-sequencing-system

22.http://www.genomeweb.com/sequencing/uk-dutch-teams-sequence-human-genomes-oxford-nanopores-minion

23.http://www.springer.com/us/book/9789401775410

24.科研論文見http://www.nature.com/gim/journal/v19/n2/abs/gim201688a.html；媒體報道見http://www.genomeweb.com/sequencing/reanalysis-clinical-exome-data-over-time-could-yield-new-diagnoses

25.http://exac.broadinstitute.org/；包含6萬個人類全外顯子組測序WES數據的大型資料庫，其基因組變異的頻率信息可以用於篩選導致罕見病或與罕見病相關的突變

26.http://gnomad.broadinstitute.org/；類似於ExAC，但數據量更大，包含12萬6千個人類全外顯子組及1萬5千個人類全基因組的測序數據

27.http://baike.baidu.com/view/798036.htm；也稱開放存取。該話題涉及學術出版界、學術界及論文評審、作者貢獻等等諸多問題。可以單獨開篇

28.http://www.nature.com/nature/journal/v542/n7639/full/nature21056.html

29.http://www.nap.edu/catalog/24623/human-genome-editing-science-ethics-and-governance

30.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1116/；專門針對遺傳類疾病，為醫生提供與臨床相關並且醫學上可操作的信息的在線定點照護資源。其內容格式類似於標準的學術期刊，包括診斷、管理與患者/家屬的遺傳諮詢

31.http://wglab.org/（王凱教授的實驗室官方網站）

32. 遺傳變異注釋軟體，官方網站為http://annovar.openbioinformatics.org/，學術論文在線發表於2010年9月的核酸研究http://academic.oup.com/nar/article/38/16/e164/1749458/ANNOVAR-functional-annotation-of-genetic-variants

33. 基因型-表型關聯分析軟體，官方網站為http://phenolyzer.wglab.org/，學術論文在線發表於2015年7月的自然方法學http://www.nature.com/nmeth/journal/v12/n9/full/nmeth.3484.html

34.遺傳變異解讀軟體，官方網站為http://github.com/WGLab/InterVar，學術論文在線發表於2017年1月美國人類遺傳學雜誌http://www.cell.com/ajhg/fulltext/S0002-9297(17)30004-6

35.http://www.nrdrs.org/（國家罕見病註冊系統官方網站）

36.比如要考慮放開二胎政策對某些遺傳病患者家庭的影響；另見2016年初Quest/Athena Diagnostics被訴其基因診斷結果導致患兒死亡的報道http://www.genomeweb.com/molecular-diagnostics/mothers-negligence-suit-against-quests-athena-could-broadly-impact-genetic；中文報道見http://www.biodiscover.com/news/industry/173710.html

37.中國「十三五」國家科技創新規劃，專欄10先進高效生物技術中提出，在生物資源利用技術方面，要聚焦戰略生物資源的整合、挖掘與利用，推進人類遺傳資源的系統整合與深度利用研究，構建國家戰略生物資源庫和信息服務平台，擴大資源儲備，加強開發共享，掌握利用和開發的主動權，為生物產業可持續發展提供資源保障。專欄14人口健康技術中提出，在精準醫學關鍵技術方面，要把握生物技術和信息技術融合發展機遇，建立百萬健康人群和重點疾病病人的前瞻隊列，建立多層次精準醫療知識庫體系和國家生物醫學大數據共享平台，重點攻克新一代基因測序技術、組學研究和大數據融合分析技術等精準醫療核心關鍵技術，開發一批重大疾病早期篩查、分子分型、個體化治療、療效預測及監控等精準化應用解決方案和決策支持系統，推動醫學診療模式變革。在生殖健康及出生缺陷防控方面，要解決我國出生缺陷防控、不孕不育和避孕節育等方面的突出問題，建立覆蓋全國的育齡人口和出生人口隊列，建立國家級生物信息和樣本資源庫，研發一批基層適宜技術和創新產品，全面提升出生缺陷防控科技水平，保障育齡人口生殖健康，提高出生人口素質。專欄24科技資源共享服務中提出，在生物（種質）資源與實驗材料共享服務平台方面，要重點加強實驗動物、標準物質、科研試劑、特殊人類遺傳資源、基因、細胞、微生物菌種、植物種質、動物種質、岩礦化石標本、生物標本等資源的收集、整理、保藏工作，提高資源質量，提升資源保障能力和服務水平。http://www.gov.cn/zhengce/content/2016-08/08/content_5098072.htm

38.從2016年起，OMIM網站頻繁跳出窗口，鼓勵使用者捐款。完整捐贈人列表在http://www.omim.org/donors

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