中科院廣州生物院發明新的分枝桿菌抗性表達盒

廣州生物院發明高效構建無抗性標記的分枝桿菌的抗性表達盒

每年的3月24日是「世界防治結核病日」，今年的活動主題是「社會共同努力，消除結核危害」。被稱為「癆病」的結核病不斷與藥物「捉迷藏」，在發病率降到低水平後捲土重來，但效率低下和不精準的藥物篩選評價模型一直阻礙新葯研發。3月24日，中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院、呼吸疾病國家重點實驗室結核病研究室張天宇課題組在《前沿微生物學》（Frontiers in Microbiology）在線發表其團隊的最新研究成果：A Cassette Containing Thiostrepton, Gentamicin Resistance Genes and dif sequences is Effective in Construction of Recombinant Mycobacteria，發明了新的可高效構建無抗性標記的分枝桿菌的抗性表達盒，該論文的第一作者為廣州生物院國際留學生Mugweru Julius。

結核分枝桿菌（簡稱結核菌）的遺傳操作比較困難，其中原因之一就是可用的篩選標記基因只有卡那黴素抗性基因（Kanr）和潮黴素抗性基因（Hygr），而且它們在實際應用中存在一定問題。結核菌對卡那黴素容易產生自發突變耐葯，因此，篩選重組結核菌株時容易篩選到假陽性菌落。此外，卡那黴素是治療結核病的氨基糖苷類藥物之一，產生的耐卡那黴素的結核菌同時對鏈黴素等其他抗結核藥物可能交叉耐葯，產生的耐葯結核菌很危險。臨床菌株有很多對卡那黴素耐葯。因此，這些菌株不能使用Kanr作為抗性篩選基因。潮黴素非常昂貴，使用量大且不同批次的質量不是很穩定。

課題組首次發現硫鏈絲菌素抗性基因（tsr）可以用作結核菌、卡介苗等的抗性篩選基因。硫鏈絲菌素相對便宜、用量少，產生自發耐硫鏈絲菌素的結核菌的突變率極低，並且它不用於治療結核，不用擔心產生對其耐葯的結核菌，而且tsr可以用於對臨床菌進行遺傳操作，較為理想。慶大黴素抗性基因（aacC1）可以用做恥垢分枝桿菌（常用的快速生長模式分枝桿菌）和大腸桿菌的抗性篩選基因。

因此，課題組把這兩個基因優化加上合適的啟動子，同時在2側加上可以被分枝桿菌Xer系統識別的可自動解離的dif序列。這樣就構成了dif-hsp60-aacC1-tsr-dif抗性表達盒。它可以用來高效構建大腸桿菌-分枝桿菌穿梭質粒，進而可以高效構建無抗性篩選標記的重組分枝桿菌，已申報專利（2016101801161450）。

該研究受到了國家自然科學基金、中科院項目、UCAS獎學金、CAS-TWAS獎學金、廣州市科技計劃項目及呼吸疾病國家重點實驗室項目的支持。

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