熒光定量PCR技術用於 食品肉類種源摻假鑒定

熒光定量PCR技術檢測動物性食品中驢源性成分具有較高的準確性與穩定性，通過熒光信號的檢測可以直接對產物進行定量。相比較於傳統的檢測方法，熒光定量PCR檢測方法具有高通量和低成本的優勢，具有廣闊的應用前景。

在國內及國際貿易中，我國肉製品摻雜、以次充好的欺騙行為屢見不鮮，嚴重損害了消費者的利益，並且對我國出口肉製品在國際市場上的聲譽造成損害。要杜絕這些摻雜使假的現象，關鍵手段是要建立一種能快速準確鑒別動物種源成分的檢測方法，為上述產品的質量做本質上的把關，提高執法的科學性和高效性，進一步提高檢驗檢疫通關速度。因此，建立一種快速、靈敏、特異的檢測肉類種源的檢測方法一直是有待解決的難題。

目前，動物源性成分鑒別的主要方法有物理、化學、免疫學和分子生物學方法。

物理學鑒別方法常用鏡檢法，通過觀察來區分禽類、哺乳動物和魚類，但該方法本身卻並不能區分動物的種類。在檢測的過程中，需要有經驗的檢驗員進行操作，可以定量檢測0.1%以下的骨片段。

化學方法進行動物源性分析主要有色譜法和光譜法兩種，但是化學方法的樣品製備比較複雜，檢測儀器相對較貴，無法分析高度處理過的樣品。

免疫學方法以檢測蛋白質為基礎，主要有同工酶檢測、酶聯免疫吸附分析（ELISA）以及電泳方法等，但其由於缺乏較高重現性和靈敏度以及受樣品性質影響而受到限制。免疫學鑒別方法主要用於鑒別粗加工肉類的動物種類，只有少數的方法可以用於檢測蒸煮肉類的蛋白質，因此很多的免疫學鑒別方法都不能用於熱處理肉品。

分子生物學方法主要有常規PCR、多重PCR、實時熒光PCR等，同時DNA雜交技術、PCR-電泳、PCR-限制性片段長度多態分析技術、隨機引物的擴增法、環介導等溫擴增技術、DNA基因檢測手段式PCR技術等也是目前發展較為領先的幾種分子生物學方法。

熒光定量PCR通過熒光染料或熒游標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟體可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。本方法檢測原理主要利用一對動物線粒體基因保守區域特異性引物，配以FQ-Buffer、耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTPs)等成分，通過聚合酶鏈反應(PCR)-熒光法進行體外擴增，從而達到快速檢測的目的。

基於熒光定量分析技術，根據常見動物如豬、驢、牛、羊的DNA序列，設計並最後確定了特異引物，建立了熒光定量PCR檢測方法，可以用於豬、驢、牛、羊肉及肉製品的種源成分快速鑒定檢測分析，具有高效、快速、準確的特點，可進行批量樣本快速檢測。方法主要用於檢測動物組織、血液以及食品、肉類製品、飼料中有動物種源性特定成份鑒定，是適用於政府檢測機構、食品加工企業、進出口貿易企業的優秀的檢測分析方法。並且檢測結果能夠達到與國家要求的行業檢測標準相一致，與歐盟、美國FDA檢測標準相符合。

熒光定量PCR技術用於食品肉類種源檢測方法建立

1 檢測原理

本檢測方法用一對線粒體基因保守區域特異性引物，配以FQ-Buffer、耐熱DNA聚合酶(Taq 酶)、四種核苷酸單體(dNTPs)等成分，通過聚合酶鏈反應(PCR)-熒光法進行體外擴增，從而達到快速檢測的目的，實現對動物組織、血液以及食品、肉類製品、飼料中動物源性成分的定性、定量分析。

2 熒光定量PCR檢測方法建立

對豬、驢、牛、羊等動物源樣品進行預處理，進而對引物和探針設計、合成及使用，經過對動物源樣品進行DNA提取與測定，構建熒光定量PCR反應體系，並在熒光定量PCR儀中進行反應，通過對反應體系、檢測手段的不斷優化，最終形成完善的熒光定量PCR檢測方法。

3 熒光定量PCR檢測方法驗證

以驢源檢測方法為例，進行熒光定量PCR檢測方法驗證。將動物組織經過勻漿、離心等預處理，進行DNA提取。應用熒光定量PCR快速檢測方法對動物組織中驢源成分進行檢測。取出驢-qPCR MIX、Taq酶系，配製測試反應體系。向每管中加入處理後樣品或驢-陽性質控品和陰性質控品，並將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內，按對應順序設置陰性控品，陽性質控品以及未知標本，並設置樣品名稱和循環條件，進行梯度循環反應，並對方法的特異性、靈敏性進行驗證。反應結束後，判斷反應結果。

檢測結果表明，本研究建立的熒光定量PCR方法具有良好的特異性，與國標方法的檢測結果符合率為100%，未出現假陽性或假陰性結果。

用試劑盒分別檢測不同濃度驢肉組織的樣品，分別為：約1/2檢測限濃度（0.05%）樣品10個、檢測限濃度（0.1%）樣品10個和2倍高於檢測限濃度（0.2%）樣品10個測定（見表1）。

表1 檢出限驗證結果

利用本方法檢測陰性樣品20份，包括豬肉、羊肉、牛肉、驢肉樣本各5份，對出現陽性結果的樣本重複檢測一次，通過陰陽性來判斷試劑盒的特異性。檢測結果表明，該方法對豬肉、羊肉、牛肉、驢肉源性成分的檢測假陽率為0。

同時，檢測含量等於或大於檢測限的豬肉、羊肉、牛肉、驢肉樣品30份，計算出假陰性率。對可疑陰性樣本重複檢測一次，統計假陰性數，計算假陰性率。按照下列公式計算假陰性率：假陰性率=假陰性數/30×100%，結果顯示該方法對豬肉、羊肉、牛肉、驢肉源性成分的檢測假陰性率為0。

此外，通過建立20多種動物樣本的物種資源庫（包括：大鼠、小鼠、豚鼠、貓、雞、鴨、鵝、鵪鶉、氂牛、馬、狐狸、貂、貉、兔、貓、豬、羊、驢、鹿等），利用熒光定量PCR檢測方法進行物種間鑒定識別，結果顯示，本方法能夠有效識別樣本物種來源，種屬間特異性檢測結果表現良好。

4 方法對比

通過實驗驗證可得，熒光定量PCR技術檢測動物性食品中驢源性成分具有較高的準確性與穩定性，通過熒光信號的檢測可以直接對產物進行定量。相比較於傳統的檢測方法，熒光定量 PCR檢測方法具有高通量和低成本的優勢，具有廣闊的應用前景。

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