美國大牛親自解讀其最新Science文章：功能微肽

關於Eric Olson Lab到底有多牛呢，大家可以看一下下面雜誌的cover吧，都是他們課題組的（光CELL就有16篇啊！）。詳情見文末Citation鏈接。

今天該課題組Dr.Z為大家帶來最新Eric Olson Lab發表的一篇Science，以及對微肽研究的看法。

Eric Olson實驗室一直致力於尋找調控骨骼肌分化發育的新基因。五年前，該實驗室通過RNA-seq 和Whole Embryo Insitu Hybridization發現了一個新基因（Tmem8c），其功能沒有被研究過。通過經典的ES Cell Targeting，該實驗室成功地將該基因敲除。

令人感到驚訝的是當該基因被敲除後，小鼠胚胎的成肌細胞（Myoblast）無法融合成具有多細胞核的肌纖維。換句話說，小鼠胚胎只是「皮包骨」，無法生成具有功能性的肌肉。由於該基因對肌肉發育的重要性，該實驗室將其命名為Myomaker。通過進一步的細胞研究，該實驗室發現當Myomaker在非成肌細胞里（例如10T1/2成纖維細胞）過表達後，非成肌細胞可以和成肌細胞融合。然而，過表達Myomaker的非成肌細胞無法自身融合。這一試驗表明成肌細胞可能還表達另外的膜蛋白，對細胞融合起促進作用。在隨後的幾年，該實驗室一直嘗試著尋找能夠和Myomaker相互作用的膜蛋白，以期待發現對成肌細胞融合起促進作用的新基因。

隨著CRISPR/Cas9技術的發展，利用CRISPR/Cas9 Library對細胞進行loss-of-function篩選變得輕而易舉。該實驗室利用CRISPR/Cas9 Library對成肌細胞進行了全基因組loss-of-function篩選。此次篩選總共使用了130209個gRNA，以確保每一個基因至少能夠被3個獨立的gRNA敲除。當對成肌細胞融合起重要作用的基因被敲除後，成肌細胞無法形成肌管（Myotube）。

形成肌管的肌細胞對培養皿的附著能力下降。通過採用不同濃度的胰蛋白酶離散細胞，形成肌管的肌細胞被選擇性地離散出培養皿。通過這一巧妙的方法，附著能力強的成肌細胞被選擇性地留存了下來。而這些附著能力強的成肌細胞理論上被敲除了重要的基因，以至無法融合成肌管。被敲除的基因通過進一步的測序來確定。其中，有一個被敲除的基因叫做Gm7325。該基因之前被標註為Long Noncoding RNA (LOC101929726)，但其實能夠被轉錄和進一步翻譯成84個氨基酸的微肽，於是該試驗將其命名為Myomixer。該實驗室首先在C2C12成肌細胞系裡將該基因敲除，發現成肌細胞無法融合成肌管。接著，又通過CRISPR/Cas9技術在小鼠受精卵內將該基因敲除，發現小鼠胚胎無法生成具有功能性的肌管。先前該實驗室發現當Myomaker在非成肌細胞里（例如10T1/2成纖維細胞）過表達後，非成肌細胞可以和成肌細胞融合。然而，僅僅過表達Myomaker的非成肌細胞無法自身融合。令人意想不到的是，當非成肌細胞同時過表達Myomaker和Myomixer後，竟然可以促使非成肌細胞融合成多核細胞。而且，當成肌細胞同時過表達Myomaker和Myomixer後，成肌細胞能夠形成巨大的肌管。這些現象表明Myomixer是一個新型膜蛋白微肽，對細胞融合起到重要調控作用。該發現刊登於美國Science雜誌。

Eric Olson實驗室之前發現的兩個微肽，Myoregulin 和DWORF對SERCA起到截然相反的調控作用。此次發現的微肽Myomixer對肌肉發育及分化又起到重要調控作用。這些發現說明微肽在生物體內的作用是不容忽視的。對生物發育，穩態調控，疾病生成都具有重要意義。

Dr.Z表示，「微肽畢竟就是一個蛋白質，只不過分子量比較小罷了。以前如果肽鏈小於一百，或者全部集中在一個外顯子內，往往就被自動忽略了。現在用新的技術例如Ribosome Profiling就可以探測到之前被忽略的微肽。但是確認微肽是否真的具有生物功能和活性，還得運用體外轉錄、ISH、敲除、過表達等傳統技術來確證。」

「目前很多微肽敲除之後，小鼠的Phenotype不是特別明顯。當然最近發現的Myomixer 是例外，因為有Embryonic Lethality.有時候微肽通過Transgenic 過表達，Phenotype雖然有的很明顯，但是不能輕易下結論。因為很多微肽是膜蛋白，過表達之後本身就會造成Folding Problem，從而激活ER Stress以及Unfolded Protein Response Pathway.」

「所以我覺得有相當一部分微肽應該是起到微調的運用，也就是Fine Tuning. 能有明顯表現型，如胚胎致死，估計少之又少。」

Citation:

1 http://www4.utsouthwestern.edu/olsonlab/research.html

2 Millay D P, O』Rourke J R, Sutherland L B, et al. Myomaker is a membrane activator of myoblast fusion and muscle formation[J]. Nature, 2013, 499(7458): 301-305.

3 Bi P, Ramirez-Martinez A, Li H, et al. Control of muscle formation by the fusogenic micropeptide myomixer[J]. Science, 2017: eaam9361.

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