《自然》子刊：華人科學家利用CRISPR插入「自殺基因」使癌細胞自我毀滅

在5月1日勞動節這天，勤勞的科學家們又在抗癌領域有了新的發現！在當天更新的《自然 生物技術》雜誌上，匹茲堡大學醫學院的研究人員發表研究，他們利用CRISPR-Cas9將癌細胞中具有特異性的「融合基因」中的特殊序列替換為「自殺基因」，讓腫瘤「自爆」，成功縮小了肝癌和前列腺癌小鼠模型的腫瘤，顯著提高了患癌小鼠的生存率[1]！

對於這個新研究，匹茲堡大學病理學系高通量基因組中心主任，同時也是研究的通訊作者，Jianhua Luo教授表示：「這是首次使用基因編輯來特異性靶向癌症融合基因。我們對此感到非常興奮，因為這可能為一種全新的癌症療法奠定了基礎。」[2]

Jianhua Luo教授

Luo教授是一位優秀的華人科學家，他曾就讀於廣州醫學院，目前是匹茲堡大學醫學院的醫生和病理學教授。過去的十幾年中，Luo教授一直致力於研究前列腺癌和肝癌的遺傳及分子機制，發現了幾個與兩種癌症有關的基因和關鍵的信號通路。Luo教授也是使用甲基化陣列和全基因組甲基化測序來分析前列腺癌的第一人[3]。

想要了解Luo教授的新研究，我們首先要知道一個非常重要的概念：融合基因。它指的是一些本來應該「沒有交集」但卻異常地「連接」在了一起的基因，這類基因會具有與「融合」前不同的功能，產生促進癌症發生和發展的異常蛋白質。

在2014年的研究中，Luo教授和他的團隊發現了一組與前列腺癌有關的「融合基因」，研究中有91%的患者攜帶其中一種或者幾種，它們的存在導致已經全部切除病灶的患者在術後不久就經歷了複發和轉移[4]。而在今年的早些時候，Luo教授又證實，之前發現的融合基因中的一個——MAN2A1-FER在其他幾種癌症，包括肝癌、卵巢癌和肺癌中也同樣存在，使得腫瘤能夠快速生長和轉移[5]。

在新的研究中，除了MAN2A1-FER，研究人員還鎖定了另一個目前在前列腺癌中特異性存在的融合基因TMEM135-CCDC67。有了兩個目標基因還遠遠不夠，他們還要確定融合基因的「斷裂點（breakpoints）」，斷裂點其實就是兩個基因在發生融合時「相結合」的位置（一段鹼基序列）。找到合適的斷裂點後，研究人員就可以把「自殺基因」插入其中，然而腫瘤對此「一無所知」，悄無聲息地就「一命嗚呼」了！

TMEM135和CCDC67基因形成「融合基因」及斷裂點示意圖

那麼「自殺基因」究竟是如何工作的呢？首先，需要將某些細菌或病毒的基因導入靶細胞中，這些基因能夠表達相應的酶，催化本來無毒的前體藥物（prodrug）轉化為細胞毒物質，這樣，攜帶基因的細胞就會被「毒」死了。這次研究中所使用的「自殺基因」是編碼HSV1-tk的基因，HSV1-tk是單純皰疹病毒1型胸苷激酶（herpes simplex virus type 1 thymidine kinase），它所對應催化的前體藥物是更昔洛韋（ganciclovir，GCV）。

在這次的設計中，研究人員利用CRISPR-Cas9技術將HSV1-tk的編碼基因插入到融合基因的斷裂點位置，催化注射入體內的更昔洛韋轉化為細胞毒物質，抑制DNA的合成，癌細胞就會加速凋亡了！而且由於「融合基因」只存在於癌細胞中，所以這種方法的特異性是很高的。

為了驗證這一點，研究人員在體外創建了兩種前列腺癌細胞系（PC3和DU145），然後分別給兩個細胞系中的一部分人為導入TMEM135-CCDC67斷裂點。通過對比，他們發現，有斷裂點的細胞死亡率要明顯高得多，而缺少斷裂點的細胞即使暴露在高濃度的更昔洛韋中，也不會有大量的死亡。這說明，更昔洛韋對癌細胞的殺傷力是具有「斷裂點依賴性」的。

兩個細胞系暴露在不同濃度的更昔洛韋中，細胞的死亡率，藍色和紅色為有/無斷裂點的PC3細胞系，紫色和綠色為有/無斷裂點的DU145細胞系

接下來，研究人員將兩種細胞系中培養的癌細胞分別移植給了小鼠，移植3周後，小鼠體內的腫瘤達到了約700mm3，然後研究人員對小鼠們進行了分組治療。同時轉進了包含gRNA、Cas9和HSV1-tk編碼基因的腺病毒的小鼠腫瘤縮小了30%，而其餘對照組的小鼠腫瘤迅速增長，增大了近40倍！在8周的觀察期中，幾個對照組的小鼠腫瘤發生轉移，相繼死亡，而治療組小鼠完全相反，既沒有出現轉移，也沒有死亡。

PC3（左）和DU145（右）細胞系腫瘤大小隨時間變化的對比（點擊可看大圖）

在驗證了前列腺癌小鼠後，研究人員又培養了肝癌細胞系（HUH7和HEP3B），同樣把它們移植給小鼠，在移植後2周，腫瘤達到244mm3的時候，給小鼠進行治療。和前列腺癌小鼠類似，接受包含gRNA、Cas9和HSV1-tk編碼基因的腺病毒治療的小鼠腫瘤縮小了29%，在8周內也同樣沒有出現轉移和死亡。

接受包含gRNA、Cas9D10A和HSV1-tk編碼基因的腺病毒治療的小鼠（藍）和對照組小鼠（紅）的存活率對比

Luo教授打比方說，「其他類型的癌症療法是針對癌細胞軍隊中的『士兵』，而我們的方法是直接瞄準『指揮中心』，這樣敵軍的士兵就沒有辦法『集結』起來。」即使出現新的「突變」，研究人員仍然可以靶向新出現的「融合基因」，進行持續的治療[2]。

儘管在這次的研究中，研究人員只是觀察到了腫瘤縮小，但Luo教授表示，這只是這種全新抗癌方法的開端，他們下一步的研究將專註於如何改良能夠「根除」腫瘤，而不再僅僅是減小。

參考資料：

[1]Zhang-Hui Chen, Yan P Yu, Ze-Hua Zuo, JoelB Nelson, George K Michalopoulos, Satdatshan Monga, Silvia Liu, George Tseng,Jian-Hua Luo. Targeting genomic rearrangements in tumor cells throughCas9-mediated insertion of a suicide gene. Nature Biotechnology, 2017; DOI:10.1038/nbt.3843

[2] http://www.upmc.com/media/NewsReleases/2017/Pages/novel-gene-editing-.aspx

[3] https://www.omicsonline.org/editor-profile/Jianhua_Luo/

[4]Yan P Y, Ding Y, Chen Z, et al. Novel fusion transcripts associate with progressive prostate cancer[J]. The American journal of pathology, 2014, 184(10): 2840-2849.

[5]Chen Z H, Yan P Y, Tao J, et al. MAN2A1–FER Fusion Gene Is Expressed by Human Liver and Other Tumor Types and Has Oncogenic Activity in Mice[J]. Gastroenterology, 2017.

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