CRISPR系統脫靶檢測方法介紹

CRISPR系統的脫靶效應一直是一個問題，因此有很多工作致力於研究如何檢測其脫靶情況。就小編接觸到的相關檢測方法，GUIDE-seq算是一個很好的檢測技術，最近Nature Methods上又出了一個檢測脫靶效應比較好的方法：CIRCLE-seq.

今天咱來介紹一下這兩種方法，首先就是GUIDE-seq[1]。其首先就是將CRISPR系統質粒和特定序列的雙鏈DNA轉染進入細胞系，然後在Cas9剪切產生雙鏈斷裂並採用非同源修復時就有可能將轉染進細胞的雙鏈DNA整合到基因組中，之後提取基因組按照正常的二代測序建庫流程建好文庫後，在經過一步靶向擴增後再里用二代測序檢測相關脫靶位置（圖1）。很明顯這樣檢測的效率比較低，因為雙鏈DNA的轉染效率是一個問題，還有就是要滿足非同源修復和恰好將轉染進入細胞的雙鏈DNA整合進基因組的概率可不是一般的低，但是咱覺得這是之前最好的方法了（其他檢測雙鏈斷裂的方法，比這個還不好）。好處就是這個還算是類in-vivo.

圖1來源：[1]

然後隆重介紹最近出來的CIRCLE-seq[2]，雖然是體外檢測脫靶效應，但是效果還是很不錯的，比GUIDE-seq等方法靈敏多了。其基本原理就是首先將基因組片段化之後環化，然後用Cas9複合物去處理，之後再連上adapter進行PCR靶向擴增（非靶標環狀DNA由於不會產生雙鏈斷裂，所以無法連接到adapter），最後上機測序（圖2）。

圖2來源：[2]

具體的操作又分為兩種方法,圖3是線性莖環法，圖4是雙鏈成環法，更喜歡簡單點的線性莖環法。USER 酶看著很熟悉啊，O2n-seq就用的這個傢伙，感興趣的讀者可以費點力點進去回顧回顧。

圖3來源：[2]

圖4來源：[2]

參考文獻：

1. Tsai S Q, Zheng Z, Nguyen N T, et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases[J]. Nature biotechnology, 2015, 33(2): 187-197.

2. Tsai S Q, Nguyen N T, Malagon-Lopez J, et al. CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets[J]. Nature Methods, 2017.

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