層析和超濾工藝過程中高蛋白濃度下的聚體形成過程

最新 06-01

摘要

蛋白生產過程中會出現局部短暫性的高濃度現象，比較典型的例子如：柱層析過程中蛋白載量接近飽和以及超濾過程中膜上的蛋白會出現高濃度的情況。柱層析和超濾都是基礎的純化技術，尤其是在蛋白藥物的生產過程中。在此，我們總結了些涉及高蛋白濃度產生條件的一些經驗。

1.簡介

對生化試劑以及診斷、治療用蛋白來講，天然穩定的處方是必不可少的，從自然組織以及重組表達的宿主中提純蛋白，柱層析和超濾是關鍵的工藝。理論上，結合在柱上的蛋白可以通過調節流動相的pH或添加劑的類型和濃度來被洗脫下來；而在超濾過程中，蛋白濃度隨著體積的減少而線性增加，在這些工藝過程中，存在蛋白濃度或表面密度過高的情況，從而導致聚體形成以及蛋白的異質性。高蛋白濃度是注射型生物藥品的主要挑戰之一。在層析過程中，層析柱載量經常處於飽和狀態，導致柱子表面蛋白密度高，甚至當柱子載量未達到飽和時，當樣品從柱子一端開始上樣時也會出現高蛋白密度的情況，這會引起蛋白在柱子進樣側達到局部飽和狀態。超濾過程中也存在類似的情況，尤其在使用壓力以及離心裝置時，蛋白會在膜表面濃縮，從而造成濃度較高的狀態。

對層析過程中出現的高蛋白濃度情況，可以通過批次結合實驗來測試蛋白是否處於飽和狀態，如果隨機結合的蛋白不能形成聚體的話，那麼高密度的結合就可能引起聚體形成。由於批次結合實驗操作不方便，因此這並不是好的解決方法，不管怎樣，還是需要通過柱層析來驗證。在超濾過程中，使用不同的裝置或膜是一種檢測方法，之前的實驗結果表明：在超濾過程中的蛋白溶液如果含有精氨酸能夠顯著抑制聚體的形成，在柱層析中，精氨酸也有類似的效果。文章中我們將描述高蛋白濃度以及高密度的背景知識，以及由此導致的一些問題。需要強調的是現在並沒有高蛋白濃度引起的一些問題的綜合性報道，但是也有一些研究的摘要，包括尚未發表的研究結果可以證明。

2.柱層析過程中的高密度狀態

許多類型的層析方法被用於純化蛋白，包括IEC、HIC、HA、複合型層析和親和層析，比如ATP柱和protein A柱，這些層析通常有很高的配基密度，表現為蛋白載量高，例如每毫升填料結合50-100mg蛋白，如此高的蛋白結合量會導致在柱表面形成高的蛋白密度，正如高蛋白濃度會引起聚體一樣，高蛋白密度一樣會引起聚體形成，如果蛋白上樣量小於填料載量，那麼柱本身未飽和，高蛋白密度的情況會避免。

假設蛋白結合量低於飽和狀態不會引起聚體形成，但是這個假設並不簡單。儘管柱子並沒有飽和，柱的頂部，也就是進樣的地方會局部達到飽和的狀態，當蛋白溶液垂直進入柱子的時候，蛋白會結合在柱子上部，當蛋白持續進樣時，頂部會先達到飽和的狀態，在這種飽和的狀態下，蛋白會在填料表面形成單獨的一層並且處於高密度狀態，高密度的蛋白會引起的主要問題就是在洗脫過程中的蛋白解吸附和聚體形成，是否高密度會引起回收率降低以及聚體形成可以通過後續的批次結合試驗來驗證。

當進行IEC層析時，也發現當用NaCl來進行洗脫時，蛋白的構象發生了改變，也就是說，不論是在柱層析模式或是批次結合模式下，蛋白結合并不飽和但是比較強，這時出現了兩個洗脫峰，第一峰鑒定為單體峰，第二個峰則是由於構象改變引起的，蛋白在層析過程中構象改變之前也被間接的證明過。當洗脫過程用精氨酸代替NaCl，那麼雙峰的現象就會消失。精氨酸主要降低蛋白分子間的結合力，在反相過程中也出現了雙峰的情況。當在不飽和狀態下結合比較強的話，柱上結合可能會導致蛋白構象的可逆變化。

3.批次結合實驗

批次結合并不運用於治療性蛋白的生產，經常用於研究，其蛋白上樣過程是在容器中將懸浮的填料與蛋白充分混勻，蛋白隨機結合到填料上，這種方式不會引起填料局部飽和。成功的例子比如：a.單克隆抗體柱層析過程中由於局部密度高會導致形成白色的一層物質，進而引起聚體形成，而在將填料和蛋白提前孵育後再裝柱，則大大降低了填料表面的蛋白密度；b.通過protein A層析親和純化Fc融合蛋白，需要洗脫pH低於3，同時蛋白易沉澱，而通過將填料與蛋白孵育後，洗脫pH可以更高同時也無沉澱，這表明高蛋白密度會導致聚體的形成，儘管這種批次結合實驗不能用於產業化生產，但是可以用來純化試劑用蛋白，因為其要求相對比較低。

4.空間排阻色譜法（SXC）

當蛋白結合趨近飽和時，蛋白分子間的斥力和靜電作用力會降低填料的結合載量，高度無鹽的狀態會克服排斥力並加強分子間的作用力，高分子量的PEG以及硫酸銨常用來沉澱蛋白，最近Gagnon開發的新型層析（SXC）是基於PEG的不解離性質，這對於運用PEG分離聚體有更好的應用，當在IEC或HA層析時添加PEG，蛋白的結合會更緊密，特別是聚體，因此它能更好的將單體和聚體區分開來，SXC用的填料不帶配基，蛋白結合通常不存在，然而大分子蛋白如單克隆抗體在存在PEG的時候能結合，並在填料表面形成複雜的層，結合的蛋白通過降低PEG的濃度來洗脫。

5.凝膠過濾

凝膠過濾（SEC）由於其本身的性質，因此不存在結合和高密度的現象，也就是說，填料的載量微乎其微，不過其所謂的結合是非特異性吸附，因此需要的填料面積大來更好的進行非特異性吸附，實際上，在脫鹽過程中，柱頂部也會由於非特異性吸附而飽和，我們開發了流動相中含有精氨酸的方法可以用來:1.降低或消除非特異性吸附;2.提高脫鹽過程回收率高;3. 精確計算抗體濃度;4.延長柱子的使用壽命。

6.進樣包含精氨酸

精氨酸對抑制蛋白之間的相互作用非常有效，因此可以通過在樣品中加精氨酸來抑制蛋白表面的相互作用，在純化重組interleukin-2時，IEC層析用其他鹽進行洗脫時發現會有不同程度的聚體，通過在樣品中添加0.2-0.25 M乙酸鈉後可以降低一半的聚體，但是回收率提升不明顯，這是由於醋酸鹽能夠降低靜電作用並因此降低柱頂部存在的局部飽和狀態。此外，添加0.2 M精氨酸，聚體幾乎降為0，這是由於添加精氨酸能夠更加明顯的降低蛋白之間的作用力。

HIC中也存在類似的高蛋白濃度的情況，在上樣過程中加入精氨酸可以改善疏水結合力和聚體的形成，同時蛋白回收率也能夠顯著提高，然而，過高濃度的精氨酸會導致蛋白結合力的下降，精氨酸能夠將柱層析過程中的樣品分布情況破壞，其主要原因是精氨酸本身的解離性質以及靜電作用力的下降。

7.流動相中添加添加劑

在流動相中加入鹽或精氨酸能夠顯著的改善層析性能，在金屬親和層析過程中，我們之前遇到過洗脫樣品渾濁的現象，當載量較低時，沒有出現該現象，而在放大後，載量接近10mg/ml時，渾濁現象出現，但是當在洗脫液中加入150 到300mM的鹽時，該現象消失。

類似的聚體形成情況在親和純化重組抗原時也出現，當通過柱層析時，會形成白色的一層，而當批次結合實驗時，該現象消失，然而即使通過批次結合實驗，通過鹽洗脫樣品依然會渾濁，通過添加1 % CHAPS或0.5 M Arg後，渾濁消失。

在親和層析中，通過在洗脫液中加入精氨酸可以提升蛋白回收率，降低聚體形成，為了更好的推動protein A的應用，我們致力於該研究，洗脫抗體或Fc融合蛋白主要通過低pH洗脫，這會造成局部結構改變進而引起聚體形成，而當加入精氨酸後，可以調高洗脫pH和回收率。

Fc融合蛋白通過Fc區與protein A結合，由於其非天然蛋白，因此更容易形成聚體，可以通過添加精氨酸來使得洗脫pH變得溫和。

親和層析對於純化帶標籤的蛋白非常方便，如protein A，ATP，GTP，其游離的配基可以用於競爭洗脫，而通過精氨酸洗脫可以降低成本。

抗原親和層析可以用於純化抗原抗體結合蛋白，由於其特異性強，會導致蛋白出現高密度，柱層析過程中蛋白構象的改變可以通過加入精氨酸來改善，主要是由於精氨酸能夠降低蛋白之間的結合力以及精氨酸簇的形成。

8.局部高蛋白濃度

層析過程中蛋白濃度不是一直不變，傳統的如超濾過程，超濾在治療性蛋白以及試劑蛋白的純化過程中是比較關鍵的步驟，用於替換緩衝液和濃縮。小規模的時候，水和小分子可以通過離心或壓力的方式透過半透膜，蛋白濃度在膜表面濃度會變得很高，在抗體超濾過程中，尤其在低溫過程超濾時，易出現渾濁現象，而加入精氨酸可以降低聚體的形成。

治療性抗體由於需要高劑量，因此需要超濾至高濃度，高蛋白濃度會形成高粘度，而且需要更合適的處方，然而超濾過程中形成高蛋白濃度與小的親水半徑有關，甚至是2nm，在protein A層析低pH洗脫的時候也出現小的水合半徑，只有溶菌酶的10倍小。這主要是由於處於低鹽或pH下，靜電作用不能完全被隔離，而在高蛋白濃度下，過量的體積佔主要作用。

聚體問題也存在於大規模的細胞培養過程中（200L），主要是由於局部蛋白濃度過高以及壓力大等原因。

9.結論

高蛋白濃度以及高密度會引起聚體形成，將填料與樣品孵育、加入添加劑如精氨酸可以降低或消除聚體的形成，主要是通過降低蛋白分子之間蛋白與填料表面的相互作用力。

參考文獻：

Arakawa T, Ejima D, Akuta T. Protein aggregation under high concentration/densitystateduring

chromatographic and ultrafiltration processes. Int J Biol Macromol. 2017 Feb;95:1153-1158.

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