新稿速遞┃髮狀念珠藻、集胞藻及小球藻胞外多糖的理化性質及氧自由基清除能力的比較

髮狀念珠藻、集胞藻及小球藻胞外多糖的理化性質及氧自由基清除能力的比較

蔡露陽*，范華，焦文冬，劉寧，王寧

(陝西科技大學 食品與生物工程學院，陝西 西安，710021)

摘 要：提取純化髮狀念珠藻、集胞藻及小球藻胞外多糖，研究其理化性質及氧自由基清除能力。採用醇沉法提取髮狀念珠藻、集胞藻及小球藻的胞外多糖並經透析得到純化的髮狀念珠藻、集胞藻及小球藻胞外多糖EPSF、EPSJ和EPSX。對3種胞外多糖進行光譜測定、分子量測定以及氧自由基清除能力的測定，比較分析其理化性質和氧自由基清除能力。研究表明，EPSJ的得率最高，是EPSF的4.10倍、EPSX的1.84倍。3種多糖都不含有澱粉、酚羥基和硫酸基，但含有一定量的蛋白質和糖醛酸。EPSJ、EPSF、EPSX中均存在β-糖苷鍵，並且EPSJ和EPSX中還存在α-糖苷鍵。EPSF為低分子質量多聚糖，而EPSJ和EPSX為高分子質量多聚糖且組分相對均一。EPSF、EPSJ及EPSX都具有一定清除氧自由基的能力，其中EPSF最強，EPSJ次之，EPSX最小。與EPSJ和EPSX相比，髮狀念珠藻胞外多糖EPSF提取物產量較低，但具有更高的氧自由基清除能力。

關鍵詞：髮狀念珠藻；集胞藻；小球藻；胞外多糖

髮狀念珠藻(Nostocflagelliforme)隸屬於藍藻門念珠藻屬[1]，在生長代謝過程中分泌的胞外多糖，具有抗氧化活性、免疫活性和抗腫瘤活性[2-4]。集胞藻(Synechocystisssp.PCC6803)隸屬於藍藻門集胞藻屬，是研究光合作用的重要模式生物[5]。小球藻(Chlorellapyrenoidosa)隸屬於綠藻門小球藻屬，適應能力強，繁殖速度快[6]。目前尚無集胞藻和小球藻胞外多糖理化性質及抗氧化活性的相關報道。

本項目研究了集胞藻和小球藻胞外多糖的基本理化性質及氧自由基清除能力，並與髮狀念珠藻胞外多糖進行比較，為3種藻類胞外多糖的進一步研究，如多糖代謝調控方面，作為保健品、藥物等方面的開發利用提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

髮狀念珠藻(Nostocflagelliforme)由陝西科技大學微生物製造研究室保藏；小球藻(Chlorellapyrenoidosa)與集胞藻(Synechocystisssp.PCC6803)均購於中科院水生生物研究所淡水藻種庫(FACHB)。

硼砂、明膠、CHCl3、FeCl3，天津市科密歐化學試劑有限公司；咔唑，國葯集團化學試劑有限公司；DEAE-52纖維素，美國Whatman公司；熒光素鈉(FL)、水溶性VE(Trolox)、葡萄糖醛酸、牛血清蛋白、考馬斯亮藍、2,2-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(AAPH)，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

超聲聚能處理系統，蘇州工業園區海納科技有限公司；紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；傅里葉紅外光譜分析儀，德國Burker公司；全波長掃描式多功能讀數儀，美國Thermo Scientific公司；旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 藻的培養

將髮狀念珠藻以10%的接種量接種於培養基BG-11中，並置於光強30 μmol/(m2·s)，光暗比12 h∶12 h，溫度白天25 ℃，夜晚10 ℃的光照培養箱內培養。

1.3.2 胞外多糖的製備

根據陳雪峰等[7]的方法提取純化髮菜胞外多糖，經離心去除藻細胞的髮菜培養液，濃縮，加入5倍體積的95%乙醇，4 ℃下靜置24 h，離心去除上清即得粗多糖。粗多糖重溶後，採用Sevage法去除蛋白質。經脫蛋白處理的多糖溶液透析48 h去除多糖中的小分子物質，最後冷凍乾燥即得胞外多糖樣品。髮狀念珠藻胞外多糖、集胞藻胞外多糖和小球藻胞外多糖分別命名為EPSF、EPSJ和EPSX。

稱量胞外多糖質量，根據公式(1)計算多糖得率。

(1)

式中：X，多糖得率，%；m1，多糖質量，g；m2，藻乾重，g。

1.3.3 胞外多糖理化性質的測定

精確配置4 mg/mL的多糖溶液，進行碘-碘化鉀反應、三氯化鐵反應、考馬斯亮藍反應、氯化鋇-明膠反應實驗，以檢測多糖中是否含有澱粉、多酚物質、蛋白質和硫酸基。

利用苯酚-硫酸法[8]測定糖含量。配置葡萄糖標準溶液，以標準葡萄糖溶液體積(mL)為橫坐標，吸光值為縱坐標繪製標準曲線，建立線性回歸方程。按照繪製標準曲線的步驟測定4 mg/mL多糖溶液的吸光值，將測定結果代入回歸方程後根據公式(2)計算樣品中的糖含量。

多糖含量/(mg·L-1)=C×F×0.9

(2)

式中：C，標準葡萄糖溶液質量濃度，mg/mL；F，測得吸光值所對應的標準葡萄糖溶液體積，mL；0.9，校正係數。

利用硫酸-咔唑法[9]測定糖醛酸含量。配置葡萄糖醛酸標準溶液，以葡萄糖醛酸質量濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光值為縱坐標繪製標準曲線，建立線性回歸方程。按照繪製標準曲線的步驟測定4mg/mL多糖溶液的吸光值，將測定結果代入回歸方程，即可求出樣品中的糖醛酸質量，然後根據公式(3)計算樣品中的糖醛酸含量。

(3)

式中：X，糖醛酸含量，%；m1，糖醛酸質量，g；m2，多糖質量，g。

1.3.4 胞外多糖的光譜測定

將EPSF、EPSJ及EPSX配製成質量濃度為0.5 mg/mL的溶液，在紫外可見分光光度計上掃描3種多糖溶液在220～400 nm區間的吸收峰，分析紫外光譜的特徵。

精確稱取EPSF、EPSJ、EPSX各2 mg進行溴化鉀壓片，測定紅外光譜(4000～400 cm-1)，掃描128次，解析度4 cm-1。

1.3.5 胞外多糖的分子質量測定

高效凝膠過濾色譜法(HPGFC)[10]測定胞外多糖的分子質量。將樣品溶於流動相中，用0.45 μm水系微孔過濾膜過濾後進樣。色譜柱為UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mm×2；流動相為0.1 mol/L NaNO3；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃。分子量校正曲線所用標準品採用Dextran T系列標準品，配製濃度為2 mg/mL。根據保留時間計算相對分子質量。

1.3.6 胞外多糖氧自由基清除能力的測定

以AAPH作為過氧自由基來源，以熒光素鈉(FL)作為熒光指示劑，以水溶性VE類似物Trolox作為定量標準，使用酶標儀對3種胞外多糖的氧自由基清除能力進行分析[11]。緩衝溶液、樣品(1 mg/mL)及FL溶液各20 μL加入酶標板各孔中，37 ℃孵育15 min後立即於各孔中分別加入140 μL新配製的AAPH，用酶標儀以溫度37 ℃，激發波長485 nm，發射波長538 nm的條件連續測定各孔熒光強度，每隔2 min測定1次，共測60次。根據公式(4)、(5)計算抗氧化劑的保護面積(ORAC值，即熒光熄滅曲線的延遲部分面積Net AUC)。

(4)

NetAUC=AUCantioxidant-AUCblank

(5)

式中：f，初始熒光強度；fi，i個測定點的熒光強度；AUCantioxidant，抗氧化劑作用下的熒光衰減曲線下的面積；AUCblank，無抗氧化劑存在時自由基作用的熒光衰減曲線下的面積。

以熒光熄滅曲線下的凈面積NetAUC值為縱坐標，Trolox標準溶液濃度為橫坐標繪製的標準曲線見圖1，回歸方程為Y=2.061x+4.917 3(R2=0.992 5)。根據標準曲線計算待測樣品ORAC值，以Trolox當量μmol Trolox/g表示。每個樣品至少做3次平行，以表示，使用SPSS19.0統計分析，顯著性水平為0.05。

圖1 ORAC標準曲線

Fig.1 The standard of ORAC

2 結果與分析

2.1 胞外多糖的得率及理化性質比較

EPSF、EPSJ及EPSX的得率及理化性質比較見表1。由表1可知，EPSF、EPSJ及EPSX均呈粉末狀並帶有一定顏色，表明其中的色素類雜質在乙醇沉澱的過程中未全部除去，其中EPSJ顏色最深。碘-碘化鉀反應、三氯化鐵反應、氯化鋇-明膠反應均呈陰性，說明3種多糖都不含有澱粉、酚羥基和硫酸基；考馬斯亮藍反應和硫酸咔唑反應均呈陽性，說明3種多糖都含有一定量的蛋白質和糖醛酸。3種胞外多糖中EPSJ的得率最高，是EPSF的4.10倍及EPSX的1.84倍，但其蛋白質含量較高(見表2)，EPSF得率最低。

表1 EPSF、EPSJ及EPSX的得率及理化性質比較

Table 1 Yield, physical and chemical characteristics of EPSF,EPSJ and EPSX

註：「+」、「-」分別表示陽性反應和陰性反應。

2.2 胞外多糖的總糖含量和糖醛酸含量的比較

EPSF、EPSJ及EPSX的糖含量和糖醛酸含量的比較見表2。由表2可知，EPSF及EPSJ的糖含量均在80%以上，分別為83.13%及85.02%，而EPSX的糖含量較低，為54.60%。EPSF、EPSJ和EPSX中糖醛酸含量也存在一定差異，EPSF中含量最高，為15.31%，EPSJ和EPSX中含量都相對較低，分別為9.31%、11.20%。

表2 EPSF、EPSJ及EPSX的糖含量及糖醛酸含量的比較

Table 2 Content of sugar and uronic acid of EPSF， EPSJ and EPSX

2.3 胞外多糖的光譜分析

紫外吸收光譜能夠反映官能團特性，對研究天然產物的化學成分與結構有著重要的意義。EPSF、EPSJ及EPSX的紫外光譜如圖2所示。由圖2可以看出，EPSF、EPSJ及EPSX在260 nm處都存在弱吸收峰且在280 nm處都不存在吸收峰，說明這3種多糖都含有少量蛋白質且不含核酸，這與考馬斯亮藍顯色反應結果一致。

圖2 多糖溶液的紫外光譜圖

Fig.2 UV spectra of EPSF，EPSJ and EPSX

紅外光譜(IR)屬於分子振動和轉動的混合光譜，主要通過檢測多糖中相關基團的振動情況來鑒定各種官能團、單糖類型及糖苷鍵，具有高度的特徵性，是分析多糖結構的有力工具，例如可以利用多糖的特徵吸收峰來鑒定多糖；利用890 cm-1，840 cm-1處是否存在吸收峰來判別β-糖苷鍵及α-糖苷鍵的存在；在1 100 cm-1～1 010 cm-1間，吡喃糖苷應有3個強吸收峰，而呋喃糖苷則只出現2個峰；1 260 cm-1與1 730 cm-1是酯基或O-乙醯基的特徵吸收峰等[12]。

3種多糖的紅外光譜圖及光譜數據分別見圖3及表3。由圖3得知，3種多糖具有相似的紅外光譜，在3 400 cm-1、2 940 cm-1、1 630 cm-1、1 410 cm-1及1 150 cm-1～950cm-1間均有一組強峰，且具有相似的結構。從圖譜中可看出3種胞外多糖具有以下結構特徵(表3)。多糖在3 600 cm-1～3 200cm-1之間的寬峰，由O—H鍵和N—H鍵的伸縮振動引起，說明存在分子間和分子內氫鍵；3 000 cm-1～2 800 cm-1間的一組吸收峰是C—H鍵伸縮振動引起的，1 400 cm-1～1 200 cm-1間的一組吸收峰是糖類的C-H變角振動引起的，這幾組吸收峰是糖類的特徵吸收峰，可初步判斷該化合物為糖類化合物。1 652 cm-1為醯胺基(RCONHR-)中醯胺Ⅰ的吸收帶，1 550 cm-1是N—H的變角振動，證明EPSJ為含有蛋白質的糖綴合物；1 140 cm-1附近的吸收峰是吡喃環的醚鍵(C—O—C)和羥基的吸收峰[13]。1 250 cm-1及850 cm-1處均無明顯吸收，說明不存在SO鍵的對稱伸縮振動的特徵吸收峰及C—O—S的伸縮振動吸收峰，因此3種多糖均不含硫酸基，這與硫酸基測定的結果相一致；3種多糖在891 cm-1附近均存在明顯的吸收峰，說明3種多糖均以β-糖苷鍵相連接，而EPSJ和EPSX在844 cm-1附近還存在明顯吸收峰，說明這2種胞外多糖除β-糖苷鍵外還存在α-糖苷鍵。

圖3 EPSF、EPSJ 和 EPSX的紅外光譜圖

Fig.3 Infrared spectrogram of EPSF，EPSJ and EPSX

表3 EPSF、EPSJ與EPSX紅外光譜數據

Table 3 The IR spectrum data of EPSF，EPSJ and EPSX

2.4 胞外多糖的分子質量測定結果

3種多糖的凝膠滲透色譜圖如圖4～圖6所示，3種多糖組分相對均一。根據樣品在 GPC中的洗脫時間，得知EPSF、EPSJ和EPSX的重均分子質量分別是2.5 ku、705.5 ku和105.1 ku，多分散性分別為1.03、1.76和7.50，說明EPSF為低分子質量多聚糖而EPSJ和EPSX為高分子量多聚糖。

圖4 EPSF的滲透凝膠色譜(GPC)

Fig.4 GPC chromatography of EPSF

圖5 EPSJ的滲透凝膠色譜(GPC)

Fig.5 GPC chromatography of EPSJ

圖6 EPSX的滲透凝膠色譜(GPC)

Fig.6 GPC chromatography of EPSX

2.5 胞外多糖氧自由基清除能力的結果

EPSF、EPSJ及EPSX的氧自由基清除能力見圖7。3種藻的胞外多糖均呈現出氧自由基清除能力，且EPSF對氧自由基清除能力大於EPSJ及EPSX。計算得3種藻胞外多糖的ORAC的當量如表4所示，由表可知，EPSX的ORAC當量為24.65 μmol/g，EPSJ的ORAC當量為44.29 μmol/g，EPSF的ORAC當量最大，為78.96 μmol/g，為EPSX及EPSJ的1.95倍及3.55倍。ORAC當量越大，樣品氧自由基吸收能力越強，其還原力越大從而抗氧化活性就越強。

圖7 氧自由基清除能力

Fig.7 Oxygen radical absorbance capacity

表4 不同樣品的氧自由基吸收能力ORAC當量

Table 4 The ORAC value of different sample

3 結論

提取純化髮狀念珠藻、集胞藻和小球藻的胞外多糖，並對其基本理化性質及氧自由基清除能力進行測定及比較，為3種藻胞外多糖的進一步研究、開發利用提供了理論基礎。3種胞外多糖中，EPSJ的得率最高(422.39 mg/g干藻細胞)，是EPSF(103.11 mg/g干藻細胞)的4.10倍及EPSX(230.04 mg/g干藻細胞)的1.84倍。3種多糖都不含有澱粉、酚羥基和硫酸基，但含有一定量的蛋白質和糖醛酸；都具有多糖的特徵吸收峰且無硫酸基的特徵吸收峰，均存在β-糖苷鍵，而EPSJ和EPSX中還存在α-糖苷鍵。EPSF為低分子量多聚糖，而EPSJ和EPSX為高分子量多聚糖且組分相對均一。EPSF，EPSJ及EPSX都具有一定清除氧自由基的能力。與EPSJ和EPSX相比，EPSF具有更好的氧自由基清除能力，抗氧化活性更高。

Comparison of physicochemical property and oxygen radical absorbance capacity betweenNostocflagelliforme,Synechocystisssp.PCC6803 andChlorellapyrenoidosaexopolysaccharides

CAI Lu-yang*, FAN Hua, JIAO Wen-dong, LIU Ning, WANG Ning

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science and Technology, Xi』an 710021, China)

ABSTRACT：The physicochemical property and oxygen radical absorbance capacity ofNostocflagelliforme,Synechocystisssp.PCC6803 andChlorellapyrenoidosaexopolysaccharides were studied in this paper. The extracellular polysaccharides ofNostocflagelliforme,Synechocystisssp.PCC6803 andChlorellapyrenoidosa(abbreviated as EPSF, EPSJ and EPSX) were precipitated by ethanol and then dialyzed. The physicochemical properties and oxygen radical absorbance capacity of EPSF, EPSJ and EPSX were studied through spectrum analysis and determination of molecular weight and oxygen radical absorbance capacity. The results showed that the yield of EPSJ was highest, which was 4.10 times higher than that of EPSF and 1.84 times higher than that of EPSX. There were not starch, phenolic hydroxyl groups or sulfate groups in three exopolusaccharides but there were protein and uronic acid in them. EPSF, EPSJ and EPSX had β-glucosidic bonds and EPSJ and EPSX also had α-glucosidic bonds. EPSF was low molecular weight polysaccharide. EPSJ and EPSX were high molecular weight polysaccharide and the components were homogeneous. EPSF, EPSJ and EPSX could absorb oxygen radical. EPSF was the best, and EPSJ was better than EPSX. The yield of EPSF was lower than that of EPSJ and EPSX, but EPSF possessed the best oxygen radical absorbance capacity among them.

Key words：Nostocflagelliforme;Synechocystisssp.PCC6803;Chlorellapyrenoidosa; extracellular polysaccharide

DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703013

收稿日期：2016-09-23，改回日期：2016-11-10

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