斯坦福大學Nat.Nanotech.：探測活細胞內吞作用膜曲率的納米級操作

【引言】

細胞膜遠不止是細胞外的一層包裹物，還將它們與內吞作用、囊泡形成和蛋白分選等重要功能聯繫了起來。專門的蛋白能夠感知和生成膜曲率，指導膜的重塑。膜彎曲可調節蛋白質活性。迄今為止，膜曲率與蛋白質的結合活性的研究已使用在體外系統中。然而這些研究需要活細胞內吞作用的驗證，極具挑戰性。至此已有研究表明膜曲率可變，相關的研究還在繼續。

【成果簡介】

斯坦福大學崔屹教授、崔便曉和David G Drubin（共同通訊作者）研究團隊開發了一種用於探測活細胞內吞作用膜曲率的納米級操作。研究證明可以使用形狀垂直排列的納米柱來控制膜曲率。在這項工作中，他們使用圖案化的納米結構得到範圍明確（+50nm～-500nm）曲率半徑的膜曲率。最終研究表明在活細胞中，CME蛋白質對高度正曲線的空間偏好超過平坦或負彎曲膜。研究還證實，膜曲率可以直接調節CME的生化活性。這些結果表明除了內吞作用外，膜曲率可能影響許多其他的細胞過程。在活細胞中精確操作膜曲率的能力為研究膜曲率對各種細胞過程的影響開闢了新的途徑。相關成果以「Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells」為題，近日發表在Nat. Nanotech.雜誌上。

【圖文導讀】

圖1 垂直的納米柱產生明確的膜曲率，誘導內吞蛋白的局部積累

a）納米柱示意圖：不同半徑（灰色）的細胞膜變形產生不同的膜曲率（紅線）。

b）一個700 nm的高梯度納米柱陣列的SEM圖像，中心距間距3μm，半徑為500 nm（左）到50 nm（右），具有14 nm的增量。比例尺：10μm。底部：如頂部圖像所示，放大單個納米柱的SEM圖像。比例尺：400nm。

c）SK-MEL-2細胞變形結構的SEM圖像，比例尺：5μm。

d）圍繞納米柱的細胞膜的TEM圖像，比例尺：100nm。

e）用CellMask Deep Red染色的質膜在納米柱位置增加的膜信號。紅色箭頭表示具有不同半徑的納米柱的位置。比例尺：10μm。

f）TEM圖：環繞納米柱的質膜填佔網格蛋白塗覆的坑。比例尺，100nm。

g）用免疫染色的方法顯示hCLTAEN/hDNM2EN細胞中網格蛋白和發動蛋白2在納米柱位置上的積累。在疊加圖像中，反轉的明場圖像被轉換為藍色（右下）。比例尺，5μm。箭頭表示具有不同半徑的納米柱的位置。

h）將32個不同半徑納米柱上的網格蛋白，發動蛋白2和膜信號量化。將相同半徑的納米柱信號平均以獲得平均的圖像。平均圖像從最大（左上角）到最小半徑（右下角）排序。顯示四個成像通道：明場，網格蛋白，發動蛋白2和脂質雙層控制表面積。

i）CLTA-RFP，DNM2-GFP和脂質膜的強度都隨納米柱半徑增加（上）。在膜強度標準化後，當納米柱半徑小於200nm（底部）時，網格蛋白膜和發動蛋白2/膜比率顯著增加。每個數據點是超過90-191個納米柱的平均值，誤差代表平均值的標準誤差。

j）從DNM2-GFP的4分鐘影片中截取的時間平均的圖片顯示DNM2-GFP表現出對尖銳的納米柱的強烈偏好，但在更大半徑納米柱（相同細胞中）的條件下，這種偏好程度將會減弱。比例尺：10μm。

圖2 多功能控制三維納米結構膜的曲率和有內吞作用蛋白質的積累

a）納米棒（頂部）和納米字母（底部，C和U）的設計示意圖，其用於通過相同的納米結構來誘導得到一系列曲率，這些曲率的範圍在平板膜和高膜曲率（頂部）以及組合正負膜曲率之間。

b）納米棒陣列的SEM圖像，每個納米棒寬150nm，長2μm，高1μm，間距5μm（左；比例尺：2μm）。頂部和右下圖像中的比例尺：1μm。

c）在納米棒陣列上培養SK-MEL-2細胞時，用CellMask Deep Red染色後看出質膜均勻包裹納米棒。比例尺：2μm。

d）從4分鐘影片中截取的時間平均的熒光圖片顯示，相比於側壁，網格蛋白和發動蛋白2更偏好納米棒的兩個高度彎曲的端部。這與c所示的膜染色圖像形成鮮明對比。在疊加圖像中，納米棒的明場圖像為藍色。比例尺：5μm。

e）分散在167個納米棒上的網格蛋白和發動蛋白2的平均圖像。比例尺：2μm。

f）以胞質為參考的納米端和納米棒中心熒光強度的定量值。統計學分析顯示納米棒末端和納米棒中心之間存在顯著差異。

g）在兩個鄰近納米棒上CLTARFP（紅）、DNM2-GFP（綠）的波動記錄曲線顯示發動蛋白2的峰值靠近網格蛋白片段末尾，其特點是網格蛋白介導的內吞作用。一般在納米端研究動態變化，而不在側壁之間或納米棒周圍。比例尺：5μM。

h）納米CUI結構在30°傾斜視圖中的SEM圖像。比例尺：2μm。

i）用CellMask Deep Red染色納米CUI陣列上的細胞的圖像，其顯示細胞膜包裹在納米C和納米U結構的內外表面。比例尺：2μm。

j）從4分鐘影片中截取的時間平均的熒光圖片顯示，網格蛋白和發動蛋白2更偏好納米C和納米U的末端和正膜曲率的外表面。比例尺，2μm。

k）51對納米C和納米U上的CLTA-RFP和DNM2-GFP的平均圖像清楚地顯示了其端部和外表面上的積聚更多。比例尺：2μm。

l）以胞質作為參考，在納米C和納米U結構的末端，外表面和內表面的量化熒光強度。統計學分析顯示在末端、外表面與內表面的差異顯著。P值如圖所示。

圖3 利用納米棒陣列探測不同種類內吞蛋白的曲率靈敏度

a）CME中不同階段蛋白質的示意圖。

b-o.高倍熒光圖像（綠色；比例尺：2μM）顯示的是在6個納米棒中不同蛋白質的分配情況。數百納米的平均圖像和沿納米棒長度的強度在熒光圖中如圖所示。

b）膜聯蛋白mCherry CAAX。

c）染色劑在納米棒的整個長度上相對均勻地分布。八種有依賴性內吞作用的網格蛋白成分中含epsin1-GFP。

d）轉鐵蛋白受體（TfnR-GFP）的高倍熒光圖像。

e）圖像顯示出對納米棒末端的輕微偏好。另一方面，用PH-GFP探測PIP2。

f）amphiphysin1-YFP蛋白的高倍熒光圖像。

g）CLTA-RFP蛋白的高倍熒光圖像。

h）DNM2-GFP蛋白的高倍熒光圖像。

i）AP2-GFP蛋白的高倍熒光圖像。

j）intersectin-GFP蛋白的高倍熒光圖像。

k）cortactin-GFP蛋白的高倍熒光圖像。

i）用環肽染色過的肌動蛋白高倍熒光圖像。

m）圖像表現出對納米棒端部的強烈偏向，沿著側壁幾乎沒有積聚。

o）沿整個長度均勻分布的納米棒是依賴窖蛋白內吞作用的一個重要組成部分，所有的納米棒長2μm。

p）通過納米棒末端與納米棒中心的歸一化強度比，定量得到的納米棒上14種不同蛋白質/染料的分布情況。對於每一種蛋白質，其分布是對平均值超過56-2,072的納米棒測量得到的。每個蛋白質與CellMask的統計學意義，通過Welch校正的非配對t檢驗進行評估。

圖4 預彎曲的膜是內吞作用的優選位點

a）沿納米柱線的DNM2-GFP的波動曲線圖顯示在納米柱位置的上發動蛋白2斑點的重複出現和消失（第1行和第3行）。而顯示出非常少的DNM2-GFP信號（第2行和第4行）。

b）DNM2-GFP點的發生頻率的空間映射展現納米柱位置的內吞作用熱點。比例尺：5μm。在6分鐘內測量了75個納米柱上的65個發動蛋白2的閃爍。每個納米柱的面積為1μm2。從同一段影片中，測量了75個平坦區域中62個發動蛋白2的閃爍，每個面積8μm2。將計算膜面積標準化後，納米柱上彎曲膜上的內吞作用顯著高於平膜。柯爾莫可洛夫-斯米洛夫檢驗的P值

c）納米柱和平坦區域上的CLTA-RFP和DNM2-GFP點的壽命分布。對於網格蛋白，在納米柱上測出226個閃爍點，在平坦區域上測出154個閃爍點。對於發動蛋白2，在納米柱上測出147個閃爍點，在平坦區域上測出260個閃爍點。為了比較納米柱和平坦區域的差異，柯爾莫可洛夫-斯米洛夫檢驗給出DNM2-GFP的P值為0.0082，CLTA-RFP的P值為0.0001，差異很大。

d）與平坦區域相比，納米柱的CLTA-RFP和DNM2-GFP的平均壽命略低。通過檢驗，DNM2-GFP與CLTA-RFP所給出P值差異很大。

【小結】

專門的蛋白能夠感知和生成膜曲率，指導膜的重塑。膜彎曲作為調節蛋白質活性的活躍分子而出現。在研究中由於肌動蛋白及其調節因子參與不同的細胞功能，從而顯示出對高度彎曲膜的強烈偏好。這些結果表明除了內吞作用外，膜曲率可能影響許多其他細胞過程。精確操作活細胞膜曲率的能力為研究膜曲率對各種細胞過程的影響開闢了新的途徑。

該文獻匯總由材料人生物材料組昝菲編譯，材料牛編輯整理。

測試谷合作入駐聯繫方式

材料人

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！