Primer Premier 6安裝、破解、引物設計實操攻略

Primer Premier是國際知名的引物設計軟體，其公司已連續發布了多個版本，到目前為止，最新版本是Primer Premier6。相比於Primer Premier 5，Primer Premier6在很多方面做了改進與優化，例如引物設計的溫度Tm值等。但是相比較於5,6並沒有出現大量的可供使用者激活的註冊機，所以用了一種很奇葩的Java破解法，來一步步看看怎麼做吧。（獲取方法點這裡）

安裝破解

首先，說明一點現在最新的Primer Premier小版本已經更新到了6.24，但後面幾版把破解漏洞修復了，所以目前只能搞定6.00。下載完資源包後，根據自己的系統，安裝相應的JAVA運行環境。

複製完應該是這樣的，如果雙擊無效的話就右鍵——打開方式——選JAVA。

如果還是不行就要改註冊表了，在開始菜單輸入「regedit」進入註冊表編輯器中，找到「HKEY_CLASSES_ROOTApplicationsjavaw.exeshellopencommand」，修改參數，保存並退出註冊表編輯器。

引物設計

安裝完之後，就要開始引物設計了，這就需要知道基因序列。一般用NCBI查找，比如要設計rat的CK18 mRNA檢測引物。首先選擇Nucleotide，然後在搜索欄輸入rat CK18，結果如下。

我們要找mRNA，所以選第一個，點進去後拉到最後的ORIGIN就能找到基因序列。

把這段序列複製到Primer Premier6進行引物設計。

點這裡的新建按鈕會出現對話框，將上面那段序列複製進去，點Add。

然後點這個搜索，出現下面對話框，這裡可以選擇引物在序列哪些地方設計引物，一般不用更改，也就是引物可以設計在整個序列，當然也可以事先查一下序列有幾個區，一般引物會跨兩個區。

接下來設置退火溫度、引物長度、產物長度等，點旁邊的「Primer Parameters」。主要更改的也就是產物長度，100到300bp為宜，產物太大，會影響擴增效率。

點「Search」後，引物序列就出來啦。

驗證引物

光設計出引物還不行，還要進行驗證，也是在NCBI上進行。在最下方找到「Primer-BLAST」將Primer Premier6設計的引物複製進去。

這麼長的驗證報告要怎麼看呢？它的結果順序是將產物由小到大排列的，而太大的產物，比如Ahsg 產物795bp，在PCR反應時是擴增不出來的。也就是說，這個引物在擴增的時候只會出CK18這個我們要的基因，特異性很好。

我們可以拿這個引物去找公司合成。在需要引物時我們也可以到文獻中查找，一般發表在全球著名雜誌中的外文文獻里的引物都是可以用的，不過要注意的是文獻中用的是染料法還是探針法，探針法的引物在染料法中效果不佳。

合作微信：helixlife6

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