全長16S rRNA精析珊瑚附著菌群，就是這麼簡單

文章首次用PacBio測序得到的全長16S rRNA序列分析海洋環境樣本，對附著在石珊瑚上的細菌群落組成及結構進行精確解析，發現不同海洋區域的石珊瑚上細菌群落組成存在明顯的差異性，同時也反映了基於PacBio測序的全長16S rRNA序列分析在珊瑚附著細菌群落中種的分類鑒定中的優勢。

珊瑚礁是一個複雜的生態系統，包含了珊瑚蟲和大量的共生生物，如腰鞭毛蟲，真菌，病毒和細菌。已有研究表明附著在珊瑚上的細菌對珊瑚的生存有重要作用。本研究基於PacBio測序的環形一致性序列CCS Read在微生物群落多樣性分析的優勢，對印度-西太平洋中附著在石珊瑚上細菌群落多樣性及結構進行分析鑒定。

研究方法

1.樣本採集：採樣區域位於印度西太平洋，分別採集泰國海灣（MN, TL, TA），安達曼海 (MT, SM, TC)共6個位點（Figure 1），每個位點取三個平行樣，共18個樣本。

2.全長16S rRNA擴增子測序：

（1）採用的是兩步法進行全長16S rRNA擴增：第一步用16S rRNA通用引物擴增，第二步加barcode序列（Figure 2）;

（2）構建兩個文庫，每個文庫包含9個樣本，分別測12個Cells，共24個Cells，上機PacBio RS II，P6C4。

3.進行全長16S rRNA的數據分析。

Figure 1 樣本採集位點：泰國海灣（MN, TL, TA），安達曼海 (MT, SM, TC)

Figure 2 兩步法進行全長16S rRNA擴增

研究結果

1.24個Cells共產出28.15Gb，polymerase read的平均讀長為25.4Kb，CCS序列平均覆蓋圈數為21.2，數據質控後共生成571,710條CCS，平均每個樣本約31,761條，質量值在99%以上（Table 1）。

Table 1 18個樣本下機數據匯總

2. 對各樣本進行OTU和alpha多樣性統計（Table 1），其中MN1的OTUs最多，而SM3的OTUs最少。雖然附著在各位點石珊瑚上的細菌多樣性不同，但整體看來泰國海灣的多樣性要比安達曼海高（Figure 3）。

Figure 3 6個位點石珊瑚附著細菌的Shannon 多樣性指數

3. 不同生境對附著在石珊瑚上的細菌群落組成有顯著影響

對OTUs進行分類鑒定，結果顯示在所有樣本中變形菌門為最優勢種群（Figure 4），其中Alpha-, Beta-, Delta-, Epsilon- 和Gamma-變形菌綱最為常見，但在泰國海灣和安達曼海兩個海域中的丰度差異很大。在安達曼海的各樣本中（MT, SM, TC），76%的序列來自Gamma-變形菌，而泰國海灣的樣本則主要為Alpha-變形菌（TA, TL）和Epsilon-變形菌（MN）。

Figure 4 基於OTUs對不同位點石珊瑚上附著細菌群落在門/綱水平的分類鑒定

多樣本相似度樹狀圖顯示附著在不同位點石珊瑚上的細菌群落組成有很大的差異，來自安達曼海的樣本中優勢種群是Gamma-變形菌綱中的螺菌目（河氏菌科）和弧菌目（假交替單胞菌科），而泰國海灣的樣本中細菌組成要複雜很多，如彎麴菌目，黏膠球形菌目，梭菌目，紅螺菌目，Ellin329和腐螺旋菌目（Figure 5）。

Figure 5 不同位點石珊瑚上附著細菌群落的多樣本相似度樹狀圖

4. 不同位點與石珊瑚相關的特有菌群

採用INDVAL的方法分析不同位點與石珊瑚特異相關的細菌種群，結果顯示MN點含有大量的特有種群，一半為alpha-變形菌綱的紅桿菌科（Aliiroseovarius,Leisingera,Roseovarius,Thalassobius和Tropicibacter），TA點和TL點的大部分特有種群為gamma-變形菌綱，而來自安達曼海的樣本的特有種群相對丰度都較低。

5. 石珊瑚相關的共有菌群

進行三個梯度的分析：一為50%樣本（即9個樣本），都含有的細菌有98種，大部分為gamma-變形菌綱（71%）和alpha-變形菌綱（11.5%）; 二為75%樣本（定義為核心種群），都含有的細菌有36種，分布在21個屬，主要是gamma-變形菌綱的弧菌科，河氏菌科，假交替單胞菌科和噬幾丁質菌科; 三為100%樣本，都含有的細菌有9種，為alpha-變形菌綱 （Caulobacter vibrioides,Bradyrhizobium rifense,Prosthecomicrobium hirschii,Reyranella massiliensis), Gamma-變形菌綱 (Endozoicomonas elysicola,Endozoicomonas euniceicola,Endozoicomonas numazuensis,Nevskia terrae) 和 擬桿菌綱 (Sediminibacterium salmoneum)（Figure 6）。

Figure 6 石珊瑚上附著的核心菌群匯總及相對丰度

6. 從全長16S rRNA序列中截取出V3-V4區域和V5-V6區域，並分別進行相應分析，結果顯示99.7%的全長16S rRNA序列可以被鑒定到「種」的分類級別，而根據V3-V4區域能鑒定到「種」的佔32%-93%不等，根據V5-V6區域能鑒定到「種」的佔71%-90%不等（Figure 7,8），總而言之，覆蓋了所有可變區的全長16S rRNA序列相對部分可變區，將更能用以精確分析和鑒定菌群。

相對短讀長獲得的16S rRNA序列的部分可變區域，全長16S rRNA序列更能精確的分析菌群多樣性，而基於PacBio測序獲得的全長16S rRNA序列，相對Sanger測序而言，更經濟，通量更高。隨著PacBio測序平台通量和讀長不斷更新，將為微生物群落多樣性和結構的精確鑒定和研究提供了一種經濟高效的方式。

未來組作為世界領先三代測序基因組中心，不斷尋找PacBio SMRT測序技術在科研中的創新應用，已於2016年開發了基於PacBio測序的全長16S rRNA擴增子測序和宏基因組分析，積累了大大小小的PacBio測序的微生物群落結構分析的項目經驗。未來組將藉助Sequel技術平台優勢進一步為研究者提供經濟高效的微生物群落研究的解決方案。

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