一個優秀的細胞工廠：黑麴黴

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黑麴黴是一種重要工業微生物，在酶製劑、異源蛋白、有機酸等領域應用廣泛。2007 年黑麴黴基因組的公布將黑麴黴的研究引入後基因組時代，各種組學數據如雨後春筍般湧現，人們對黑麴黴高效生產機制的理解上升到系統、分子層次；與此同時，黑麴黴遺傳操作系統也不斷成熟，為系統地研究和改造黑麴黴、將黑麴黴打造成通用細胞工廠奠定了基礎。

引自：郭艷梅《黑麴黴作為細胞工廠：知識準備與技術基礎》

黑麴黴是一種廣泛存在於自然界的腐生真菌，其分生孢子頭呈褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一。頂囊球形，雙層小梗 ( 圖1) ，多見於糧食、植物性產品和土壤中。黑麴黴又是重要的工業發酵微生物，在工業酶製劑、有機酸發酵方面應用廣泛。可生產澱粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶等超過30 種酶製劑。因為黑麴黴出色的蛋白質分泌能力，黑麴黴也被開發為通用的異源蛋白表達載體。黑麴黴是檸檬酸、葡糖酸和沒食子酸等的主要生產菌。

自上世紀90 年代以來，分子生物學的進步率先揭開了全面研究黑麴黴細胞工廠運作機制的序幕。一些基因得到克隆和功能表徵，一些針對絲狀真菌的分子生物學操作技術也在黑麴黴中得到實現和應用，如敲除載體、轉化方法、篩選標記等等。都為更好地研究黑麴黴的分子機制奠定了基礎。2007年前後，3 株黑麴黴菌株基因組的公布，將黑麴黴的研究推入後基因組時代。伴隨著分子生物學、系統生物學等學科的迅猛發展，黑麴黴這個高效運作的細胞工廠的神秘面紗正在被逐漸揭開，對黑麴黴細胞工廠進行重新設計和優化的能力正在逐步形成。

一、系統生物學的進步使得對黑麴黴的了解一步步深入

1.1黑麴黴基因組

近年來，有3 株黑麴黴工業菌株先後獲得測序。2000 年7 月荷蘭帝斯曼公司 (DSM) 率先啟動了對其擁有的工業酶生產菌株黑麴黴CBS 513.88 的測序計劃，其數據在公開發表之前已經提供給公眾下載(http://genome.jgi-psf.org/Aspni1/Aspni1.home.html) 。

黑麴黴基因組數據的公布為功能基因組學的深入研究奠定了基礎，轉錄組、蛋白組和代謝組方面的數據很快得到了發表，使細胞工廠設計和代謝工程研究變得更加便捷，也為通過工程手段提高工業生產菌株性能提供了新的思路和方法。

1.2 蛋白質分泌途徑

黑麴黴具有高效表達和分泌某些蛋白質、特別是各種水解酶的能力，但是並非所有異源蛋白都能夠通過黑麴黴實現過量胞外生產。真核生物胞外蛋白質的分泌是一個非常複雜的過程。分泌蛋白通常在N 端有信號肽序列，它引導分泌蛋白定位於糙面內質網膜的核糖體上合成，隨後信號肽被切除，並在內質網中進行加工、修飾；然後被運輸到高爾基體中進行進一步的翻譯後加工，形成有特定結構和功能的蛋白質；最後通過高爾基體發生的分泌小泡與質膜融合，將其包含的蛋白質分泌到細胞外，這個過程被稱為內質網- 高爾基體 (ER-Golgi) 蛋白分泌途徑 ( 圖2) 。

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1.3 代謝網路調控

在廣泛的基因組注釋和比較基因組學研究的基礎上，孫際賓等重建了黑麴黴基因組規模的代謝網路模型( 圖3) ，共涉及4 000 多個基因，999 個不同的酶序列號 (EC number) ，2 443 個代謝反應和2 349 個代謝產物。這是黑麴黴第一個全面的代謝網路模型，應用此網路模型首先分析了黑麴黴高產檸檬酸的機理。

發現黑麴黴除了豐富的多糖水解酶體系外，其糖酵解和三羧酸循環還有豐富的冗餘基因，即較多的重複基因拷貝編碼催化同一步反應的酶。典型的是檸檬酸合成酶CS 和線粒體支鏈氧化還原酶AOX 。與當時基因組序列已經公布的絲狀真菌相比，3 株獲得測序的黑麴黴菌株普遍存在額外的第5 套檸檬酸合成酶，而檸檬酸生產菌株ATCC 1015 則具有第6 套細菌來源的檸檬酸合成酶。在檸檬酸的合成過程中，氧氣被同時大量消耗。發酵過程停止通氣5 min 足以導致整個發酵過程發生不可逆的損傷。

1.4調控網路

1.5黑麴黴的系統解析

高通量系統生物學分析是理解黑麴黴細胞工廠的重要基礎，特別是近幾年來，隨著黑麴黴基因組的發布，相關研究呈現井噴趨勢。比如：最近J?rgensen 等作了類似條件下的轉錄組比較，但是實驗是在控制更精確的恆化培養條件下完成的。他們發現在此條件下以麥芽糖為唯一碳源時胞外蛋白量是以木糖為唯一碳源的3 倍以上，90 種以上與蛋白質分泌途徑有關的蛋白髮生了上調錶達，包括蛋白質ER 轉位、摺疊、糖基化、質量控制、小體裝配和運輸等，與未摺疊蛋白響應UPR 的情況非常類似。

1.6 構建黑麴黴素細胞工廠的技術儲備

1.6.1基因打靶系統

1.6.2黑麴黴表達系統優化：包括構建強啟動子，增加基因拷貝數，利用蛋白酶缺陷菌株，基因融合，篩選標記，轉化方法等。

黑麴黴作為發酵菌株的優勢

隨著越來越多的外源蛋白在黑麴黴成功表達，且被證明具有較高的產量和活性，黑麴黴成為了一個重要的酶表達體系，也逐漸成為重要的工業酶製劑生產菌種。據報道，黑麴黴可生產纖維素酶、木聚糖酶、澱粉酶、蛋白酶、糖化酶、果膠酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶等多種酶。作者綜述了黑麴黴產纖維素酶、木聚糖酶、蛋白酶、澱粉酶、脂肪酶的研究進展

引自：張熙《黑麴黴發酵產酶研究進展》

黑麴黴不僅在傳統酶製劑的發酵生產上具有優

勢，在其它新酶的生產方面也具有非常廣闊的應用前景。黑麴黴在眾多微生物表達系統中凸顯出優勢，主要有以下幾個原因：

1、首先，作為真核生物，黑麴黴細胞內擁有內質網、高爾基體等蛋白後加工模塊及複雜的基因排列方式、內含子等原核生物沒有的特徵，這些特徵使黑麴黴表達體系可以生產一些結構較為複雜的蛋白質或酶。

2、其次，黑麴黴表達體系不但擁有優秀的蛋白後加工能力，而且秉承了大部分好氧微生物生長快速、代謝旺盛、生存力強的優勢，這使得黑麴黴表達體系產出的蛋白和酶質量高、產量大。

3、另外，黑麴黴基因組中具有眾多強啟動子。有無強啟動子是微生物表達體系能否作為外源蛋白表達工具的重要參考

4、黑麴黴還具有美國ＦＤＡ認證的ＧＲＡＳ

食品級生產許可，這是許多其它整合表達系統（如畢赤酵母表達系統等）所不具備的，這也為黑麴黴在食品領域的應用提供了質量保障。

結尾

黑麴黴作為細胞工程和發酵工程的菌株，有其特殊的功能和優化，同時構建黑麴黴細胞工程的工作還剛剛起步，距離應用還有相當大的距離。隨著黑麴黴遺傳操作工具的不斷成熟，可以預見將有更多的團隊加入到黑麴黴的改造活動中，黑麴黴作為細胞工廠生產工業酶、異源蛋白質、有機酸、次級代謝產物等將呈現日益美好的前景。

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