如何為甲基化特異 PCR 設計引物
作為一個剛入門的科研新手時, 做 PCR 都是師兄師姐把所需引物、試劑拿來,再甩出一個 Protocol,照著程序性加樣、上機就行了,感覺也沒什麼技術含量。輪到做自己的課題時,還真是犯了點愁,四處請教,逛論壇看各種帖子,尋找一些設計原則,最後也算形成了自己的一套流程,可以給一些還在迷茫的初學者們一些參考。
下面以 (SOD1) 為例,一步步演示。
基因序列查找
點擊 Genomes 選擇對應的染色體標本
輸入基因名稱
選擇基因轉錄本
注意一個基因可能有多個轉錄本,在 RefSeq Genes 里選擇你要查找的序號。
查看基因序列
設置參數
點擊 submit 便出現了外顯子大寫的的基因序列,可 copy 到 word 里保存供以後參考。
在線設計引物
利用甲基化設計的網站 Meth Primer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi1)粘貼基因序列。
粘貼基因序列
包含第一外顯子和上游鹼基的基因序列。
設置條件
查看結果
網站給出的幾個參考的引物相差不大,可以根據自己的需要重新設置條件來重新設計。另外可以根據一些設計引物的原則來篩選合適的引物。我也整理了一些關於引物設計的原則,供參考。
網站給出的幾個參考的引物相差不大,可以根據自己的需要重新設置條件來重新設計。另外可以根據一些設計引物的原則來篩選合適的引物。我也整理了一些關於引物設計的原則,供參考。
參考原則
確保目標序列中有非 CpG 的 C 的個數。
如果你沒有足夠的 C 位於非 CpG 內,那麼未轉化的 DNA 和甲基化的 DNA 看上去會差不多,以 6~7 個 CpG 為理想。如果低於這個,那麼特異性會降低。你會得到非特異性的擴增,因為它區分度不夠。
讓產物短一點
亞硫酸氫鹽轉化的過程會損傷模板 DNA,因此嘗試擴增較小的片段(小於 150 bp),將得到最佳的結果。如果你通過電泳來運行產物,那麼確保你能夠將 M 引物的產物與 U 引物的分開。
遵守 PCR 的原則 PCR 引物設計的所有原則也適用於 MSP。
1)引物的退火溫度要相當,如果可以的話,將 M 引物和 U 引物設計成相同的條件,這樣可同時運行。
2)引物之間不要形成二聚體,一般引物自身連續互補鹼基不大於 3 bp。
作者:俞心
圖片來源:俞心
題圖來源:視覺中國
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