CRISPR「大脫靶」真的是「大危機？學者深度解讀：「危機」將推動行業發展

圖片來源：Nature/ Sébastien Thibault

為深入解讀這項研究的具體內容、了解基因編輯領域研究者對此的看法，科研圈專訪了上海科技大學免疫化學研究所的劉佳副研究員。劉佳博士多年從事基於純化核酸酶蛋白質的基因編輯研究，並將此方法應用於 ZFN、TALEN 以及CRISPR-Cas9 上，以提高基因編輯工具的效率、降低脫靶性。

劉佳博士認為，這一研究的發現並非能夠「決定 CRISPR 命運」。研究者的重點在於凸顯全基因組測序在檢測基因編輯結果（特別是單核苷酸突變）中的重要性，讓大家更仔細地檢測可能存在的「脫靶」效應，這一研究對整個行業起有推動作用，而非造成「大危機」。學界因此意識到，CRISPR 基因編輯技術尚有不少未知的內涵需要探索；同時，我們也應該科學、謹慎地看待這一研究對 CRISPR 臨床研究的指導意義。

科 = 科研圈

劉 = 劉佳博士（上海科技大學免疫化學研究所）

科：對 CRISPR 系統脫靶效應的研究並不在少數，為什麼這篇論文尤其引人關注？

劉：實際上這篇文章主要強調的有兩點，第一點是在動物體內進行實驗，觀察到經過基因編輯的動物它的子代中產生的脫靶效應、特別是之前人們很少關注的單核苷酸突變（single-nucleotide variants, SNVs），第二點就是研究中用了全基因組測序（Whole-genome sequencing，WGS）。雖然此前研究中有用到 WGS 檢測「脫靶」位點（如論文中所引用的參考文獻 3），但是更多的是全外顯子測序，這往往導致了在外顯子區域之外的一些「脫靶」位點不能被很容易檢測到。比如文章的圖1b 這個表格就顯示，外顯子區域只檢測出了幾十個脫靶突變，而全基因組範圍檢測出了上千個脫靶突變。這也顯示了這篇文章想要突出全基因組測序的意義。同時，這個表也說明了，人們一直忽視的、單核苷酸突變（SNVs）的頻率，實際遠遠大於核苷酸插入與缺失（Indels）。

論文圖1b：WGS SNVs 及 WGS indels 表示使用全基因組範圍內檢測到的脫靶突變；Exon SNVs 及 exon indels 表示使用外顯子區域檢測到的脫靶突變。它們所檢測到的突變數量相差巨大。

實際上，這篇文章是一篇 correspondence，也就是讀者來信。文章最開頭其實就已經寫明主旨：大家對於 indels（插入或缺失）之外的突變類型，即 SNVs（單核苷酸突變）並未深入研究過，而且很少用全基因組測序的方法。作為個例研究，它的確揭示了一些大家以往未關注的現象，所以自然受到大家的重視。

科： Cas9 是現在 CRISPR 系統裡面用的最多的一類酶；去年NatureBiotechnology上有一篇研究（Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells）報道，使用 Cpf1 的進行基因編輯時脫靶率顯著低於 Cas9 系統，為什麼它沒有取代Cas9？

劉：實際上 Cas9 根據來源不同也分為很多種，大小不同、活性不同、特異性不同，它們識別的 PAM 序列也不同。其中 Spy（Streptococcus pyogenes，釀膿鏈球菌）來源的 Cas9，是科學家第一個開始研究，也是目前研究的最深入、最廣泛的一種，因此關於它的優點和缺點我們都相對很了解。從去年NatureBiotechnology上發表這個文章當中看，Cpf1的確脫靶效應比 Cas9低，但 Cpf1能否取代 Cas9，還需要後續更多更系統性的研究。大家在考慮脫靶效應時更多是考慮用什麼樣的方法能降低脫靶效應，這個實際上是件很難的事，特別是在體內應用的時候。

科：一些人認為這篇文章的對照設置得不好，您如何評價？

劉：如我前面所說，這篇文章是一篇 correspondence，實際上就是想論證一個非常小的點，並不強調研究的系統性。假如要進行系統性的研究，確實要設置非常多的對照，論證邏輯要非常完美。這篇文章，實際上只是通過全基因組測序揭示了之前人們不大關注的 CRISPR-Cas9 「脫靶」效應。作者這篇文章更像是起到了「拋磚引玉」的作用，讓大家更仔細的檢測可能存在的「脫靶」效應。雖然Nature Methods上的研究性 correspondence 不強調系統性，但是往往也要經過同行評審。

科：為了觀察基因編輯過程造成了哪些突變，這一研究選擇了進行過基因編輯和未編輯的其他小鼠做為對照，而沒有用進行基因編輯前後同一隻小鼠的不同狀態互相對照，這是為什麼？

劉：這個涉及到基因編輯實驗的複雜性，需要明白技術的操作流程。首先，研究者需要將 Cas9 蛋白質、編碼 sgRNA 的質粒及目標基因的修復模板，通過顯微注射的方法注射到受精卵中；等到被編輯的受精卵發育為成鼠，這隻小鼠便作為親代，與其他小鼠雜交繁殖子代，之後再鑒定子代是否發生目標基因的突變。這就導致了並沒有同一隻小鼠編輯前後的狀態，只存在顯微注射與否這兩種狀態。實驗中所應用的三隻小鼠，其實都是子代，實驗組的小鼠親代經過了 Cas9 處理，而對照組的未經處理。

科：這篇文章的作者沒有選擇打分最高的一種 sgRNA 進行實驗，這是怎麼回事？

劉：文章在正文第二段話中說了研究的選擇標準，他們測試了四個 sgRNA，然後選擇了在切割位點上活性最高的一種。其實這樣從實驗角度來看也是有道理的，大概可以理解是為了更有效治療小鼠先天失明。他確實沒有選擇打分最高的那一種 sgRNA。打分不僅僅是考慮了切割的活性，而是會將如靶點編輯效率和脫靶率等因素也同時考慮進去。

科：作者把這兩隻實驗的小鼠的脫靶位置進行了比較，發現兩隻小鼠的脫靶位置有1500多個是重合的，研究者把這些位點稱為「非隨機脫靶」。這種非隨機脫靶意味著什麼？

劉：傳統上，大家在研究脫靶效應時，最開始要先預測一下。比如補充材料中的第三張圖，研究者在圖 a 中先預測了有哪些脫靶位點。以往的研究會根據這些預測的位點逐一檢查，或者做全外顯子測序，但這篇文章做了全基因組測序，發現了大量未預測到、看似隨機的突變。它們跟 sgRNA 的序列相差很多，卻也能被 Cas9 切割。這些位點在被編輯的兩隻小鼠中有很多重合，說明這些位點並非背景噪音，也不是由於外界變化引起的隨機的突變，而是處理過程引起的（Cas9蛋白質、sgRNA 表達質粒、寡聚核苷酸模板或其組合效應）。

文章補充材料 Figure 3：根據 sgRNA 序列預測的脫靶位點（a） 與 實際脫靶位點（b, c, d）

這些看似隨機的突變與所使用的 sgRNA 序列關聯性並不大，是很難預測到的，與其說是「隨機」不如說這些突變是「不相關的」、「關聯性低的」；然而事實上，這些位點其實並不是隨機的，而有一定的傾向性，即這些突變在同一個體系下，即同一種Cas9、同一種 sgRNA 的設計時，得到的脫靶結果有一定傾向，所以才造成了兩隻進行基因編輯的小鼠脫靶位點中有很大一部分重合。但為什麼有這種傾向性目前還不清楚，其中可能有一些東西是大家不理解的，大家對此還沒有研究。

這次研究者預先用計算機模擬預測的脫靶位點，沒有一個實際上發生突變，這也說明了我們在認知上還有一些不清楚的地方，但我覺得預測模擬還是有用的，並且確實研究者發現，使用預測來進行 sgRNA 設計的結果比隨意設計要好，這已經有很多文章證實了。目前 CRISPR-Cas9 領域有很多 sgRNA 的設計網站或軟體，基本都是以序列匹配程度為原則進行計算的，但具體演算法可能會有差別；它們的確具有一定的先進性，但隨著科學的發展，一定會出現更好的預測演算法。

科：目前許多針對 CRISPR-Cas9 的研究，都是為了提高內切酶的活性，或者降低脫靶效應，有不少相關研究的文章已經發表。但對於這篇文章發現的脫靶效應，我們看到作者表示「我們並不確定，通過設計改造 sgRNA 或應用高保真的 Cas9 能否降低脫靶突變。」（It is not clear whether improved sgRNA design or use of high-fidelity Cas9 may reduce off-target mutations），您怎麼評價？

劉：其實他們提出這句話是有前提的。這篇文章的這種觀點，實際上就是希望引起大家討論：基於現有知識設計的 sgRNA 或者 Cas9，究竟能不能解決所有脫靶效應的問題。我們已經發現一些問題，超出了現有知識範圍，那麼用現有的優化方法或者設計能不能解決它呢？這也就不確定了，因為現有的這些優化方法是根據現有的知識建立的。這篇文章因此才會引出這樣的一個討論。

其實這個文章並沒有發表任何超出其內容涵蓋範圍的觀點，也沒有對現有的解決方法表示強烈的質疑，因為畢竟這不是一項系統性的研究，所以下結論的時候也非常小心。

科：在解決脫靶問題時，現在有哪些比較值得關注的嘗試？

劉：其實在 CRISPR-Cas9 誕生之初，大家就認識到存在脫靶效應的存在，有各種各樣的方法來應對，前人也有一些綜述總結，並且還會不停有新方法出現。現在有一個領域大家比較關注，叫做 Anti-Cas9 protein，即針對 Cas9、可以使它滅活失效的一類蛋白質，最近在Cell上發表了許多此類研究。還有一些其他的方法，比如不引起雙鏈 DNA 的斷裂，僅僅使鹼基替換，這個也是可行的。但是如果說有什麼方法能夠保證沒有脫靶效應？對此其實也沒有什麼共識。

科：CRISPR-Cas9 系統目前廣泛地應用在動物建模中，這篇論文對於動物建模會有什麼實質的影響嗎？

劉：論文支持材料中的附表3，就是想說明全基因組測序發現了一些脫靶產生的indels，其中 Mouse Phenotype 那一列，說明這些脫靶的 indels 可能會引起相關小鼠表型的變化。這說明做動物建模的時候需要更加小心。

很多用基因編輯進行動物造模來驗證基因功能的實驗，其意義便在觀察基因突變後動物能否產生實驗假設中的表型變化。這篇文章就提示我們，在基因編輯過程中不可預知的一些突變也能引起動物表型上的一些變化，也就是說，不能一隻動物出現這樣的表型，就說這種表型就是由被編輯的基因突變引起的，這得需要更多動物驗證，排除這種表型不是由於一些隨機或者不可預知的脫靶效應引發。所以這篇文章在這個意義上也是說給大家敲了一個警鐘。

補充材料附表3：在 CRISPR 治療小鼠中檢測到發生 indels 突變的外顯子及其在小鼠和人類中對應的表型。從左向右每一列分別為：檢測到突變的子代小鼠編號、基因名稱、基因突變位點、該突變引發的小鼠表型（參考目前已有研究得到）及該突變引發的人類表型。

科：研究人員一般會使用全基因組測序的方法，檢測通過基因編輯得到的動物模型嗎？

劉：根據我目前所了解，大部分情況下，研究人員做好基因編輯的動物之後大多不會做全基因組測序。大多數情況下都是檢測計算機預測「脫靶」位點的突變情況以及全外顯子測序。當然，也有部分在幹細胞或植物中的研究的確是通過全基因組測序檢測「脫靶」效應的。

以後的趨勢現在很難講，但這篇文章出來後，我認為大家會慢慢開始關注這個問題，畢竟這的確是基因編輯中存在的一個問題。或許新的測序方法出現能夠使鑒定過程更快更好，但就目前技術來說，全基因組測序確實是最全詳細、覆蓋度最高的方法。

科：您之後的研究考慮在基因編輯後應用全基因組進行檢測嗎？全基因組測序的成本是否非常高昂？

劉：這個我們是有考慮的。實際上現在我們實驗室也在跟一些其他實驗室合作一些項目，就是想要降低 Cas9的脫靶效應，在我們後續的實驗當中，我們確實考慮用全基因組測序來驗證。全基因組測序的成本是相對比較高的，比全外顯子測序要高不少。全外顯子測序一般實驗室還可以承擔，全基因組測序對於一般或是經費不太充足的實驗室來講還是有些困難。

科：去年四川大學華西醫院盧鈾教授團隊開展了全球首個利用 CRISPR-Cas9 系統治療肺癌患者的臨床試驗，是通過在體外對 T 細胞進行基因編輯，之後再把經過改造的 T 細胞輸送回人體內。您覺得Nature Methods這項新發現會對這項臨床試驗造成什麼樣的影響？

劉：這很難講，因為二者實驗的方式還是很不一樣的。首先最不一樣的一點就是物種差異，這篇文章使用的是小鼠，臨床試驗是以人為對象的，物種差異首先就非常大；另一種很大的差異就是細胞類型，文章中編輯的是受精卵，臨床試驗中處理的是 T 細胞。細胞類型不一樣會造成脫靶位點不同，在受精卵中發生的脫靶位點，不一定會是 T 細胞中的脫靶位點。對不同類型的細胞進行相同位點的編輯，脫靶位點會有很大差別，對此大家早已有了共識。

至於這篇文章對臨床試驗會不會有消極的影響呢？我們要從科學角度思考，要嚴謹一些。如前所述，這篇文章不是系統性研究，因而我們需要更系統性的工作，才能獲得對臨床研究具有指導意義的結論。

科：相對於前幾代基因編輯方法，如鋅指核酸酶、TALENs 等方法，人們對 CRISPR 的期待是不是更大一些？

事實上，CRISPR-Cas9 技術從2012年出現到現在，已經出現過很多次類似的「危機」，而每次「危機」都伴隨著技術的改進與提升。這篇文章對基因編輯結果的檢測手段提出了討論，對整個行業應該是具有十分積極的推動作用。

-完-

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