CRISPR引發小鼠體內基因突變屬於過度解讀？

2017 年 5 月 30 日，《自然·方法》（Nature Methods）刊登了一篇文章。來自哥倫比亞大學等機構的研究人員發現，在治癒小鼠相關疾病遺傳性疾病的同時，基因編輯常用的工具 CRISPR/Cas9 可能會造成很多意料之外的基因突變。

文章刊登後引發了十分廣泛的關注。一方面，CRISPR/Cas9 作為最有效的基因編輯工具之一，已經廣泛應用到各類研究中。另一方面，中國已經開始利用該基因編輯技術的臨床試驗。

圖丨相關研究報告已於5月30日發表在《自然·方法》官方網站上

CRISPR 到底是否會帶來意想不到的副作用？有人認為，CRISPR 作為本世紀最偉大的技術之一，其缺陷被人為忽視了。而也有人認為，論文中提到的實驗用小鼠並不是好的研究對象，其得出的數據是片面的，缺乏可靠性。

為此，DT君專門採訪了上海科技大學研究副教授劉佳博士。劉佳博士的研究方向為用基因編輯技術的改進和應用。以下是經過整理後的採訪內容：

問：這篇論文是以什麼形式發表的？

劉佳：這篇文章是以 correspondence 的形式發表在《自然·方法》（Nature Methods）上，correspondence 這種形式可以翻譯成研究者投稿。與其他類型的文章（Brief Communications 或 Articles）相比，correspondence 不強調研究的系統性，而強調時效性，有時候不夠全面。

《自然·方法》設置這個欄目的宗旨就是能及時分享給大家有用的信息，哪怕相關信息不夠全面。

問：目前有學者批評這篇文章有對照組設置不全等缺陷，請問您如何評論？

研究性質的 correspondence 仍然需要同行評議，而且《自然·方法》也是高水平的雜誌，所以數據可靠性和學術上的價值很可能還是可靠的。

問：這篇文章到底說了什麼？

劉佳：這篇論文非常簡潔，如果翻譯出來篇幅也不長。文章內容在第一段已經把主題說得很清楚，就是大家之前在分析 CRISPR/Cas9 的脫靶效應的時候，考慮的可能不是那麼全面，需要更加重視全基因組測序（Whole Genome Sequencing，WGS）的作用。

基因編輯中出現的脫靶包括不同的形式，例如單核苷酸差異（single-nucleotide variants，SNVs），以及核苷酸的插入與缺失（insertionsand deletions, indels）。

從技術上來說，文章通過顯微注射技術將 Cas9 核酸酶蛋白質、單鏈寡聚脫氧核苷酸（single-stranded oligodeoxynucleotides, ssODN）模板注射到小鼠的受精卵（zygotes），建立起雜合的親代小鼠。研究者採用全基因組測序（WGS）分析了由親代小鼠繁殖出的子代小鼠的突變情況。

通過和對照（未經過基因編輯）小鼠比較，基因編輯小鼠出現了更多「脫靶」的Indels和SNVs。同時，這些 SNVs 「脫靶」位點和設計的 sgRNA 具有較低的同源性，因而很難被傳統的方法預測到。

之前的研究中，大家常常用全外顯子測序的方法檢驗 CRISPR/Cas9 是否影響了基因組的其他位置。從某種意義上來說，全外顯子測序只檢查編碼蛋白的部分。另外，雖然也有科學家使用WGS檢測動物上的「脫靶」效應（例如文章中所引用的參考文獻3），但傳統檢測手段更關注於 「脫靶」效應引起的核苷酸插入與缺失（indels），而不是單核酸突變（SNVs）。

而在這篇文章中，作者表示，他們使用了全基因組測序的方法後，發現了一些以前沒有發現的脫靶效應。所以，這篇文章受到了不小的關注。

問：為什麼此前的全基因組測序沒有發現這些新產生的脫靶效應？

劉佳：雖然此前研究人員的確使用全基因組測序研究過脫靶效應，但是使用頻率不如全外顯子測序高。全外顯子測序某種意義上可以理解為只檢測編碼蛋白質的序列。

這是因為全外顯子測序的成本比較低，在基因編輯技術剛出現的 2014 年，國內實驗室要做一個全基因組測序可能需要幾萬元。如果一個實驗室需要樣本，設置不同的組，再重複幾次，可能一個實驗室一年的經費就沒有了。

這兩年，全基因組測序的成本降下來了，然後大家又對安全性格外關注，所以才會更多地考慮用全基因組測序來對編碼區和非編碼區同時進行測序，以此檢測基因編輯的副作用。

問：這篇文章確實提到了基因編輯技術會導致一些意想不到的突變，是否會影響之前的利用相關技術研究的可靠性，提升臨床試驗的風險？

劉佳：從科學的嚴謹角度來考慮，每個研究都需要在嚴格界定條件的情況下才能獲得有意義的結論。在基因編輯領域也是如此。實際上已經有很多實驗證實，細胞類型、Cas9核酸劑量、sqRNA設計等條件會對脫靶效應等基因編輯的結果造成非常大的影響。

這項研究使用的是小鼠受精卵，通過顯微注射將 Cas9 等相關元件注射到細胞中。同時，文章通過全基因組測序分析了 indels 和SNVs。無論是實驗條件還是分析方法都和此前研究有很顯著差別，不能直接用來比較。

此外，這個文章作為一篇correspondence也不是（或者不需要）很系統，它只是給大家這麼一個信息，實驗完整性相對此前的很多研究還是有一定差距。

一個研究能進入臨床試驗，說明前期相關研究人員的工作非常系統。在中國現有法律的規定下，如果要通過臨床試驗的審批流程，研究數據要非常紮實，在研究系統性上往往要遠遠超過一篇高水平的文章能提供的信息。

如果你看一下這篇論文，會發現作者在遣詞造句的時候非常謹慎小心，只是希望讓大家意識到全基因組測序的重要性，除此之外沒有多餘的評論，更沒有認為這篇文章會對相關的臨床試驗有任何指導意義。

醫療技術能進入臨床，說明無論是從醫院的角度、國家的角度，還是實驗室自己信心的角度來說，都已經看到了非常確鑿的依據。系統性、具有生物相關性的研究，將對今後的臨床實驗更具有指導意義。

圖丨哥倫比亞大學研究團隊的實驗結果數據比對

問：這篇文章會對行業產生什麼樣的影響？

劉佳：這篇文章主要討論的是基因編輯的檢測方法，證實了通過全基因組測序可以揭示出非預期的「脫靶」效應，特別是單核苷酸突變。但是對 Cas9 的好壞，以及基因編輯本身的安全性等問題沒有進行討論。文章主要希望表達的內容是，全基因組測序這一之前不是很常用的方法，可以更全面地分析 CRISPR/Cas9 地脫靶效果。

此項研究給行業帶來的最大變化是，科研人員在對 Cas9 基因編輯結果分析時將更多地考慮全基因組測序，並分析除了核苷酸插入與缺失之外的單核苷酸突變。

對科學界來說，這篇文章報道了一個案例，不能否定整個行業。Cas9 作為一個強大的工具，在很多地方都有不同層面的證據支持它的有效性，換句話說，它已經有系統性的證據進行支持。而反觀這篇文章，本身並不是系統性的工作，只是舉出了一個觀測案例。作者也沒有試圖質疑整個領域。

事實上，CRISPR/Cas9技術從 2012 年出現到現在，已經出現過很多次類似的「危機」，如「脫靶」效應等。但是，每次「危機」都伴隨著技術的改進與提升。

總之，這篇文章對基因編輯結果的檢測手段提出了討論，對整個基因編輯領域的健康發展很有好處，對整個行業起到了非常積極的推動作用。研究沒有否定基因編輯行業的之前的工作，只是提升了行業標準。

Cas9 從 2012 年才開始得到應用，現在生物領域只要做生物醫藥的基本都會使用這一工具。短短 5 年時間就發展成現在這樣的規模，非常罕見。正是因為如此，Cas9檢測方法的提升可以讓整個生物醫學領域都受益。

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