CRISPR遭遇信任危機，放眼四大基因編輯技術探討如何規避「脫靶」風險

最新 06-05

今天是2017年6月4日

農曆五月初十ASCO 2017

醫麥客向全球癌症攻堅者致敬

基因編輯復活恐龍，龍糧你準備夠了嗎？

有人說，人類是這個地球上最孤獨的種群，因為他們擴散到哪裡，哪裡的野生動物就會滅亡。不過，現代科學技術的發展已經到了「起死回生」的地步，或許我們可以將那些已經滅絕的動物重新帶回來。

小夥伴們還記得那些年《冰河世紀》中萌萌的猛獁象嗎？你能想像4000多年前銷聲匿跡的猛獁象重新出現在世人面前嗎？科學家們正在談論用一種強大的基因編輯技術讓猛獁象起死回生，更有新聞報道稱兩年內便可夢想成真。

那是不是說

《侏羅紀公園》里的噩夢也要實現了呢？

但小編想問的是：「龍糧準備夠了嗎？」

基因編輯，指哪打哪

復活滅絕動物的可能性可不是小編杜撰的，畢竟基因編輯確實足夠「黑科技」。

那基因編輯的神奇魅力何在呢？

它能夠讓人類對目標基因進行「編輯」，實現對特定基因片段的敲除、加入等。它就像一把手術刀，可以根據基因錯誤的位置進行修改。如果人類能夠完全掌握基因編輯技術，面對許多疾病，人類將不再談虎色變。從根本上避免致病基因遺傳給後代，解決某些感染性疾病的預防和治療難題，而且可能真的就像上帝造人那樣，隨心所欲地塑造「完美寶寶」。

目前人類應用的基因編輯工具中主要有三種：ZFN，TALEN和CRISPR-Cas，還有一種就是質疑不斷的NgAgo技術。

ZFN技術

20世紀90年代，科學家發現，一種廣泛存在的蛋白結構模塊鋅指(ZF)能夠介導蛋白質與核酸間的相互作用，將這些模塊化的鋅指串聯起來，所形成的蛋白能夠特異性識別並結合DNA，這種蛋白就是鋅指蛋白(ZFP)。研究發現，鋅指蛋白可以實現對DNA的識別，由核酸酶進行精準切割。這也是第一個基因組編輯技術—鋅指蛋白核酸酶技術(ZFNs)。

經過十幾年的發展，鋅指核酸酶技術已應用於果蠅、斑馬魚、大鼠、小鼠等多種模式動物的遺傳研究，成功實現了基因的修飾。2005年，它還首次實現了對人類細胞基因的定點修飾。

ZFN特異性識別DNA並與DNA結合示意圖。每個DNA識別域包含三個鋅指，鋅指從N端開始命名，在圖中標示為F1、F2、F3。每個鋅指結構分別與3個鹼基發生直接接觸，由此產生特異性。單獨的FokI切割域不具有特異性識別能力，但當與鋅指結構相連，並與另一個FokI切割域形成二聚體後，便能夠對DNA雙鏈進行切割。

值得我們注意的是，ZFN技術也存在著一定的缺陷。

其對DNA的剪切需要兩個FokI切割區域的二聚化，並且需要至少一個識別單元結合DNA。DNA識別域雖然具有較強的特異性識別能力，但由於ZFN剪切的過程並不完全依賴同源二聚體的形成，所以一旦形成異源二聚體，就很可能造成脫靶效應，並最終可能導致DNA的錯配和序列改變，產生較強的細胞毒性。當這些不良影響積累過多，超過細胞修復機制承受的範圍時，便會引起細胞的凋亡。

另一方面，該手段仍然受到現有生物學領域研究手段的限制，因此在細胞內部操作的精確程度和後果都較難預料。如果ZFN引起相關基因突變，則可能會導致一系列意想不到的後果，在與人體相關的應用領域，甚至可能引發癌症。

另外，ZFN作為基因治療的手段之一，如果在生物體內使用，可能會引發免疫反應。現有的研究手段尚不能預測引入的ZNF蛋白是否會引起免疫系統的進攻。並且到目前為止，ZFN技術只能用於體外操作，而直接向患者體內導入相關ZFN元件進行基因編輯處理則具有較大的潛在風險，且效率不高。以上諸多限制導致人體相關的ZFN操作較為繁瑣，耗時費力，成本也高，因此沒有得到大規模的應用。

TALEN技術

TALE是一種從植物病原體—單胞桿菌中分離出來的蛋白，這種蛋白能夠通過特異性結合宿主DNA，調控其表達來提高病原體的致病性。TALE蛋白與鋅指蛋白最大的不同體現在，TALE蛋白的重複單元與DNA的鹼基是按照一對一的識別方式特異性識別的。而且相比使用鋅指蛋白靶向DNA序列更加穩定，特異性也更高且不受序列的限制。

TALEN進行基因組編輯的原理。利用位點特異性核酸酶可以進行基因組編輯，而核酸酶誘導的DNA雙鏈斷裂（DSB）可由同源定向修復（HDR）或非同源末端連接途徑（NHEJ）來修復。

理論上TALEN技術可以實現對任意基因序列的編輯，原理與鋅指核酸酶技術相似。TALEN作為第二代基因組編輯核酸酶，與其它技術相比，其能更大程度上的地避免功能蛋白脫靶。

與鋅指核酸酶相比，TALEN使用起來更簡單、構建更迅速，並且價格更低廉。TALEN不像ZFN那樣容易受周圍連接環境綁定的影響，因此與ZFN相比，其設計和工程沒有ZFN複雜。與此同時，由於它們具有與DNA靶位點結合的高度特異性，因此與其它工具酶相比較，TALEN產生的脫靶效應非常微弱。

但是裝配TALEN編碼質粒卻是一個冗長的、高強度工作的過程。

CRISPR技術

20世紀80年代末，研究人員在觀測大腸桿菌時發現，在細菌基因的尾端，有一些看上去很奇怪的重複序列。這些序列隨後被命名為成簇的規律間隔的短迴文重複序列（CRISPR）。病毒性感染就像定時炸彈，在它「爆炸」之前，細菌只有很短的時間來處理，而CRISPR就是一個「拆彈專家」。

CRISPR-Cas9

那CRISPR是如何「拆彈」的？

研究人員注意到，這些重複的序列之間總是由一些很古怪的間隔區隔開，這些間隔區之所以看上去很古怪，是因為它們根本就不是細菌自身所有的東西，而是從噬菌體病毒的DNA上「剪」下來的小片段。簡言之，細菌細胞產生CRISPR相關蛋白（Cas蛋白），在病毒入侵之後，Cas蛋白便會結合到病毒DNA上，從上面「剪」下一塊病毒DNA，然後將其轉運到細菌細胞的基因組，插入其中，使之成為一處「間隔區」。

從此以後，細菌細胞便會利用這一間隔區來識別與之相對應的病毒，實現對病毒再次入侵的免疫應答。更神奇的是，CRISPR系統還可以將獲得的部分DNA片段整合進基因組，形成記憶並遺傳，從而可以保護後代的細胞免受病毒的攻擊，就像隨身帶了一張基因的「疫苗接種卡」。

CRISPR的登場，把基因治療的武器庫升級到一種前所未有的高度。更便宜、更便捷、靶向更加準確。

NgAgo技術

除了以上三種基因編輯技術之外，2016年5月份，河北科技大學韓春雨副教授及浙江大學的團隊平地一聲炸雷，祭出NgAgo這個神奇的武器，基因編輯能力和脫靶副作用均大大優於已經接近完善的CRISPR技術。相比CRISPR/Cas9技術使用RNA引導，NgAgo基因編輯技術以DNA作為引導工具，可選擇的靶點更多、準確性更高、脫靶效應更小。

NgAgo

但自問世以來便陷入了論文不可重複性的風波中。雖然至今都無人能證實，但很是賺足了眼球。不過儘管目前有不少科學家對NgAgo技術作為基因編輯技術存在質疑，但是河北科技大學基因編輯技術研究中心仍在積極推進以Argonaute核酸酶為核心的基因編輯技術開發及其相關知識產權的轉化和應用。

總的來說，相比較ZFN、TALEN、甚至是存在質疑的NgAgo技術，CRISPR技術的更便捷、靶向更精準的優勢則相當惹眼。CRISPR的另一個主要優點是「擴大」的能力。多種gRNA可同時用於編輯各種不同的遺傳基因座，為研究涉及由多個基因引起的疾病提供可能。

CRISPR可以說是一種革命性的技術，沒有任何一種技術能如CRISPR這般快速橫掃整個生物學界。但畢竟這項技術比較新，因此其治療學方面的發展明顯落後於其他基因編輯技術。並且目前還不清楚CRISPR技術在未來是否能被證明適用於人類健康治療。就目前看來，其易產生脫靶效應仍是一項重大的挑戰。

遭遇「大危機」，數百種意料外的脫靶突變

5月30日，《NatureMethods》期刊上的一篇題為 Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo的一篇通信文章顯示，來自美國哥倫比亞大學等研究機構的科學家確認通過CRISPR基因編輯技術成功修復了導致兩隻小鼠失明的基因後，經全基因組測序發現小鼠體內有超過1500個單核苷酸發生突變，並有百個以上的位點發生發生了大片段的缺失和插入。

WGS SNVs及WGS indels 表示使用全基因組範圍內檢測到的脫靶突變；Exon SNVs及exon indels表示使用外顯子區域檢測到的脫靶突變。它們所檢測到的突變數量相差巨大。

StephenTsang博士（哥倫比亞大學醫學中心/人類營養研究所眼科學、病理和細胞生物學副教授）作為該文章的重要作者之一，他表示CRISPR 脫靶效應導致的基因突變所產生的潛在危害是至關重要的，這些突變包括單核苷酸突變以及基因組非編碼區產生的突變。

而且研究人員一般並不會使用全基因組測序手段去檢測脫靶效應導致的基因突變位點，並且可能忽視了潛在的重要突變位點，因為即便是單鹼基突變也有可能造成較大的影響。

Stephen Tsang博士

StephenTsang博士希望他們的研究能夠鼓勵其它研究人員使用全基因組測序技術去檢測使用CRISPR技術所致的突變位點，以開發出更加安全和精準的基因編輯技術。

理性的來說，這篇簡短的通信文章，其初衷本就是引發討論而非蓋棺定論，在更多證據出來之前，我們並不能一棒子打死，輕率地說CRISPR-Cas9有著嚴重缺陷。畢竟科學的本質就在於不斷地質疑與討論，既然是質疑，就存在合理亦或是不那麼合理。

如何規避「脫靶」風險

在CRISPR系列的基因編輯系統中，Cas9酶是一個非常關鍵的組成部分，更是「元老級」的成員，但是CRISPR/Cas9的脫靶效應是一直急需攻克的難題。在CRISPR技術向醫學臨床不斷轉化的過程中，科學家們正想法設法的解決這一重大技術難題，希望形成更精準的基因編輯系統。

近日，《Nature Methods》同時刊登的兩篇研究中，發表了兩種分析CRISPR/Cas9基因組編輯脫靶效應的新方法。其中一種方法可以鑒定細胞類型特異性SNP相關的脫靶突變，另一種則可以檢測潛在脫靶切割位點。

在此之前，在全基因組範圍鑒定脫靶效應的細胞方法也時有報道，但這些方法可能錯過低頻率的脫靶突變，而且高效轉染的要求也限制了其應用。相比之下，體外篩查策略則具有一定的優勢。它不需要高效轉染，避免了細胞適應性的影響。此外，活性核酸酶的濃度可以儘可能高，將低頻率突變一網打盡。

第一項研究：來自麻省總醫院（MGH）和哈佛大學的研究人員開發了一種新的體外篩查方法CIRCLE-seq，該方法是一種高度靈敏的體外篩查法，比現有識別CRISPR/Cas9全基因組脫靶突變的細胞學或生化方法更有效，表現更佳。

為了檢測新方法的靈敏性，研究人員將靶向HBB基因的sgRNA的脫靶結果與利用另一種方法Digenome-seq識別的脫靶結果進行比較。結果發現CIRCLE-seq 鑒定出Digenome-seq已檢測到的29個位點中的26個，並且還檢測到156個其他方法無法檢測的新位點。

研究人員表示，與Digenome-seq檢測到的結果相比，CIRCLE-seq具有更高的信噪比，而且使用的測序reads減少了一百倍，這可能是由於該技術在識別全基因組範圍脫靶位點方面具有更高的靈敏度。

Caribou Biosciences 公司 CEO Rachel Haurwitz

第二項研究：在同一期的雜誌上，CaribouBiosciences和DuPont Pioneer的研究人員介紹了另一種名為SITE-Seq的生化方法，它利用通過嚮導RNA編程的Cas9來鑒定基因組內的切割位點。該技術使用了sgRNA 編程的Cas9對基因組DNA中的剪切位點序列進行識別。

研究人員表示：「我們使用 SITE-Seq檢測靶向人類基因組的sgRNA與Cas9的特異性。識別的位點數量依賴於sgRNA序列和核苷酸濃度。低濃度條件下鑒定到的位點更有可能是細胞中的脫靶突變。細胞中具有活性的脫靶位點會受到sgRNP傳遞、細胞類型和在核苷酸環境接觸的持續時間影響。

總而言之，我們的結果強調了在評估核苷酸活性和特異性時，將全面的脫靶位點生化識別方法與基於細胞的活性檢測方法結合的有效性。」

SITE-Seq過程包括了選擇性的標記、富集、測序，以及將將切割後的基因組 DNA 與對應的參考基因組比對。最終比對結果中，sgRNP切割產生的位點會生成一個特殊的信號，可以通過計算檢測，研究人員還表示，這個信號與Digenome-seq檢測到的信號相似。

除此之外，在Cas9消化處理的人類胚腎基因組 DNA 中也檢測了該方法，結果發現SITE-Seq靶向的 771 個生化切割位點。研究人員接下來將 AAVS1 sgRNA 轉染到穩定表達Cas9–GFP的HEK293細胞中，3 天后進行脫靶編輯。他們從最初的 771 個包含大範圍核苷酸替換的位點中選擇了68個位點進行評估，發現29個細胞脫靶位點的突變頻率在0.1%-66.6%。

對此，CaribouBiosciences 公司 CEO Rachel Haurwitz 表示：「通過向研究人員提供一種精確定位CRISPR-Cas 活性的基因組區域，我們可以選擇活性和特性行最高的靶點來減少脫靶效應的發生，從而使CRISPR-Cas9成為一種安全且有效的基因編輯工具。」

其實在CRISPR-Cas9問世之初，大家就認識到存在脫靶效應的存在，如果克服了這一難題，那麼CRISPR技術用於人類治療的安全性就能得到很大的提高。由此我們可以知道，在保持CRISPR技術優勢的基礎上，努力突破其限制壁壘將是未來幾年基因編輯技術發展的大趨勢。

參考出處：

doi:10.1038/nmeth.4293

doi:10.1038/nmeth.4278

doi:10.1038/nmeth.4284

http://www.genetics.org/content/188/4/773

http://www.cell.com/trends/biotechnology/pdf/S0167-7799(13)00087-5.pdf

https://www.eurekalert.org/pub_releases/2017-05/cumc-cge052617.php

http://www.sci-news.com/genetics/crispr-cas9-mutations-04903.html

http://newatlas.com/crispr-gene-editing-causes-mutations/49762/

https://phys.org/news/2017-05-crispr-gene-hundreds-unintended-mutations.html