未止科技：Nature超詳細解析！帶你探索心肌細胞再生的奧秘

心臟病、心肌梗死等心臟系統疾病是目前全球矚目的疾病。我們知道，由於心肌細胞（CM，cardiomyocyte）的有絲分裂後的特性，成年哺乳動物的心臟是無法再生的，這就導致了心臟系統疾病的不可逆性，使其成為了極為棘手的醫學問題。

近日剛剛發表於《Nature》的一篇論文針對心肌細胞無法再生的問題進行了研究，該研究團隊發現了一種胞外基質（ECM，extracellular matrix）蛋白能夠大幅提升心肌細胞再生的效果，他們命名這種蛋白為Agrin。

低等脊椎動物中，例如蠑螈和斑馬魚，他們的心肌細胞增殖以及心肌細胞再生功能都極為強大，但較為高等的哺乳動物卻反而缺乏這種能力。有趣的是新生的小鼠的心臟在其生命的第一周也具有極強的再生能力。

該研究展示了在這一周內，小鼠ECM的組成變化是如何影響心肌細胞的生長和分化的。

首先，為了研究ECM在心臟再生中的作用，科學家們調查了在小鼠出生後ECM對於CM的再生影響。 P1和P7是通過去細胞化產生的無細胞ECM片段（擴展數據圖1a，b）。在體外只處理P1，ECM片段同時提升了P1和P7的CM細胞周期活性（圖1a-d）。同時使用廣泛的MMP抑制劑（Marimastat）導致CM由P1的ECM引起的CM增殖下降（圖1e，f）。

原位酶譜法測定底物裂解特異性的實驗表明MMP2/9與心肌細胞再生有關（圖1c-e）。實際上，MMP9的裂解在條件培養基中誘導P1或P7的CM增殖（圖1g，h）。質譜測定法（LC / MS）分析顯示，相對於P7的ECM片段，Agrin在MMP9裂解的P1中含量極為豐富（擴展數據圖2a）。此外，科學家們鑒定出了Tgfbi，它是骨膜蛋白的旁系同源物。隨後通過qRT-PCR驗證了P1和P7的基因表達水平（擴展數據圖2b）。這些結果均闡明了用於體外鑒定促進CM增殖的ECM相關分子的新方法的效果。

擴展數據圖2a-b

圖1a-k

接下來，科學家們進一步證明了Agrin表達與內皮細胞並且能夠在體外提升CM增殖效率。圖1i-k通過對成人心臟進行RNA、Western blot和免疫熒光分析，展示了在P1和P7之間Agrin的表達的下調。心臟內皮細胞（EC）的P1 Agrin mRNA的表達明顯多於成纖維細胞（FB）和CM（圖1l，擴展數據圖3）。擴展數據圖4a-d這些結果表明，Agrin可以在體外刺激CM增殖。

圖2a-p

擴展數據圖3

擴展數據圖4

為避免圍產期致死的Agrin無效突變體的干擾，科學家們通過將MesP1Cre+/-、Agrnflox/+小鼠與Agrnflox/flox（Agrin-cKO）小鼠雜交來有條件的刪除心臟中的Agrn（圖2a）。Agrin的蛋白和mRNA的表達分析證實等位基因已被刪除（圖2b-d）。 Agrin-cKO CMs表現出更為成熟的肌動蛋白結構並增強肌節的α-輔肌動蛋白和Cav3、T小管標記物的共定位（圖2e）。同樣，Myh6/Myh7的量化比例（圖2f）和染色線粒體標記物Tom20（圖2g）均顯著升高。P1 Agrin-cKO心臟部分顯示CM細胞周期活性下降（圖2h，i）。結果表明Agrin在新生兒階段抑制CM成熟（P1-P14，圖2e-g，擴展數據圖5a，b）。

擴展數據圖5a-k

Agrin cKO中CM輕度肥大可以認為是明顯的證據（擴展數據圖5c，d）。此外，Agrin cKO展出1個月時射血分數輕微下降，在之後的某一時間點消失（擴展數據圖5e，f），心/體重比和纖維化染色不受影響（擴展數據圖5g，h）。最後，該研究團隊檢查了Agrin-cKO小鼠心臟再生是否受損。P1小鼠進行心臟切除術後於第1周和第4周進行評估（擴展數據圖5i），Masson的三色染色檢查顯示相對於野生型同窩出生者，纖維化所有所提升（圖2j-1），符合心臟功能降低的結果（圖2m，n和擴展數據圖5K）。相應的，Agrin-cKO中的CM增殖減少（圖2o，p）。這些結果證明了Agrin是新生小鼠心臟再生所必需的，但嚴格來說，並不是出生後心臟生長或功能維持所必需的。

擴展數據圖6a-g

隨後科學家們檢查了重組Agrin是否可以促進CM的幼年和成年的增殖以及心臟再生（擴展數據圖6）（圖3）。對小鼠進行左前降支動脈（LAD）永久性結紮並在心肌內注射Agrin（50μl，20μg/ ml）或PBS（作為control）（擴展數據圖6a）。Agrin誘導CM細胞周期在與梗塞區域相鄰的健康心肌中重新恢復（圖3a-c和擴展數據圖6b，c）。MI後4天對成年個體的心臟進行組織學分析，結果顯示兩組的情況相似，然而從第14天起，兩組的損傷面積出現差異，在Agrin治療的心臟中，疤痕區域減少，在第35天顯著減少（圖3d，e和擴展數據圖6d）。此外，超聲心動圖可以看出MI之後，在這兩種模型中Agrin治療都可以改善心臟功能（圖3f，g和擴展數據圖6e，f）。Agrin處理的小鼠也顯示出防止心肌病的效果（圖3h和擴展數據圖6g）。Agrin存在於注射後72小時的梗塞心臟中，儘管其水平逐漸下降（擴展數據圖7a，b）。

圖3a-h

擴展數據圖7

α-dystroglycan （Dag1）在P1中廣泛表達（擴展數據圖8a，b），然而P8的RNA和蛋白質表達被CM所限制（圖4a-c和擴展數據圖3）。但在P1或P7中，MuSK表達非常低（圖4a）。在單核細胞成熟期，Agrin-Dag1信號傳導促進ERK激活（圖4d）。Dag1-Agrin結合位點的阻斷抗體（IIH6C4）減弱了Agrin誘導的ERK活化（圖4e）。此外，使用PD0325901或抗Dag1抗體阻斷Agrin誘導的P7Mc增殖（PD，MEK抑制劑）（圖4f，g）。用Agrin處理P7心臟培養物2和48小時並通過甘油梯度分離分析全細胞提取物（圖4h）。

圖4a-n

經過2小時的治療，重組Agrin存在於含有DGC的分組中，表明Agrin與該複合物相結合（圖4h）。分離自CMs並接受Agrin治療的肌原纖維顯示Myh6、α-輔肌動蛋白（Actn2）和Desmin（Des）的含量逐漸減少，這一發現說明細胞骨架的完整性符合CM去分化過程（圖4i）。Agrin誘導P7中的CMs的肌節分解（擴展數據圖8d），這與經Agrin處理後心肌肌鈣蛋白T表達完全缺失的CM數量上升了2.5倍的結果相一致（圖4j）。

擴展數據圖8a-b

DGC成分的co-IP證實，Agrin和Yap都依附於DGC（圖4k）。Agrin治療後，β-dystroglycan和Yap從複合物分離（圖4l）。因此，在CM里，Yap的細胞核百分比在Agrin治療後增加了3-4倍（圖4m）。Agrin無法在verteporfin存在的情況下誘導CM增殖（圖4n）。Agrin通過Dag1與DGC結合并降低其穩定性，導致肌原纖維分解並激活Yap和ERK等信號分子（擴展數據圖9）。

擴展數據圖9

為了評估Agrin的轉移能力，科學家們通過在明膠塗層上培養2D基板研究了Agrin是否能夠促進源於人誘導多能幹細胞（hiPSC-CMs）的CM增殖。依據hiPSC-CM細胞周期活性給予人或大鼠集胞苷的劑量（圖5a，b）。延長給葯（100ng / ml，兩周）的人類Agrin提升了CM細胞周期活性約22倍（圖5c）。此外，Agrin治療顯著降低了細胞成熟速度（圖5d），並降低了功能和成熟標記的表達（圖5e，f）。

圖5a-e

綜合分析這些研究結果，得出了與在小鼠中一致的結論，即不論在2D和3D培養系統中，人類Agrin不僅可以促進CM增殖並且能夠減緩人類iPSC-CMs的成熟。

參考文獻：

Elad Bassat, Yara Eid Mutlak, Alex Genzelinakh, Ilya Y. Shadrin, Kfir Baruch-Umansky, Oren Yifa, David Kain, Dana Rajchman, John Leach, Daria Riabov Bassat, Yael Udi, Rachel Sarig, Irit Sagi, James F. Martin, Nenad Bursac, Shenhav Cohen, Eldad Tzahor. The extracellular matrix protein Agrin promotes heart regeneration in mice. Nature, 2017; DOI: 10.1038/nature22978

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