一文讓你了解數字PCR技術、原理及應用

一．PCR的發展歷史

PCR技術自問世以來，在遺傳病、病原體、癌基因等分子診斷領域和法醫鑒定等方面發揮了巨大作用。第一代 PCR在進行擴增後通過凝膠電泳進行定性分析。

隨著生物分子熒光技術的發展，1992年實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 應運而生。qPCR是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質熒光強度來測定每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環後產物總量的方法。由於在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關係，所以Ct值也就成為定量的依據。基於熒光探針或染料的第二代 PCR 技術隨後逐漸發展為檢測核酸目標片段的主流分子診斷學技術。

在實時定量 PCR（qPCR） 過程中，熒光信號隨著擴增產物的積累而增強。qPCR 能夠實時獲得模板擴增的熒光值，然後根據DNA 模板在指數增長時期的 Ct 值與標準 DNA 的Ct值比較來計算初始模板的濃度。但是這種方法由於是大體積反應系統，非特異性的擴增增加了假陽性結果和背景信號，因此，最終無法獲得絕對定量的結果。

隨著MEMS工藝的不斷成熟和微流控技術的不斷發展，新一代PCR技術，數字PCR(digital PCR, dPCR) 也隨之出現。digital PCR是一種新的絕對定量PCR，主要是對PCR反應物進行有限稀釋，隨後在不同的反應腔室里進行PCR擴增，最後根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例得出靶分子的起始拷貝數或濃度的技術。

圖1. PCR技術的發展歷程

二．數字微流控（dPCR）的原理

20 世紀末，Vogelstein 等提出數字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR 擴增，擴增結束後對各個反應單元的熒光信號進行統計學分析。

dPCR是一種核酸分子絕對定量技術。

圖2. dPCR基本原理

dPCR一般包括兩部分內容，即PCR擴增和熒光定量分析。

在PCR 擴增階段，與傳統技術不同，dPCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，並平均分配到幾萬個反應腔室里反應。這樣子相當於變相的對靶基因進行富集。與此同時，由於對原樣品的大幅度的稀釋，使得PCR抑製劑濃度顯著降低，這樣dPCR對初始PCR反應物里抑製劑的要求顯著低於qPCR。

不同於 qPCR對每個循環進行實時熒光測定的方法，dPCR 技術是在擴增結束後對每個反應單元的熒光信號進行採集，最後根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例得出靶分子的起始拷貝數或濃度。

圖3. dPCR可以實現痕量核酸的高靈敏檢測

三．dPCR與qPCR的對比

相對於熒光定量PCR（qPCR）而言，dPCR具備以下優勢：

1、靈敏度可達單個核酸分子：檢測限低至0.001%，原因在於dPCR可以實現靶標DNA/RNA的富集；

2、無需標準品（標準曲線），即可對靶分子起始量進行絕對定量；

3、特別適合基質複雜樣品的檢測：終點PCR檢測，不依賴Ct值，不依賴擴增效率，能克服PCR抑製劑的影響，適合動血樣、FFPE組織、糞便、尿液、痰液、水樣、土壤、植物等複雜樣品中DNA的絕對定量；

4、能夠有效區分濃度差異（變化）微小的樣品：更好的準確度、精密度和重複性，可以用於精確測定靶基因的相對表達，基因拷貝數變異分析等。

圖4. qPCR和dPCR的對比

四．dPCR的多指標檢測的實現

圖5. dPCR的多指標並行檢測的實現方式

如同qPCR一樣，dPCR中實現多指標的並行檢測能顯著降低檢測成本，獲取更豐富的檢測信息。

不同於qPCR中的多腔室擴增與多熒光通道結合的並行PCR方式，在dPCR里，一個微反應腔室里一般只含一種靶基因。

所以dPCR的多指標檢測主要通過以下兩種方式實現：

1. 多個熒光通道。使用多種熒光染料來標記不同的要檢測的靶基因。

2. 單波長多強度。使用一種熒光染料，但是擴增結束時不同的靶基因對應的染料的熒光強度不一樣。

五．dPCR的分類以及相關的產品

微流控晶元技術能夠快速並準確地將樣品流體分成若干個獨立的單元, 從而進行多步平行反應，並且具有成本低、體積小和高通量等特點，是理想的數字PCR平台。按照其獨立的單元的實現方式來細分，dPCR又分為基於液滴微流控（droplet microfluidics）的微滴數字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）和基於晶元式微流控的微陣列晶元式PCR。

5.1微滴數字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）

微滴數字PCR主要是將兩種互不相溶的液體，以其中一種作為連續相（油），另一種作為分散相（水），在水/油兩相表面張力和剪切共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在於連續中，從而成液滴。這種液滴式的反應腔室具有體積小、樣品間無擴散等優勢。

在ddPCR中，利用微滴發生器可以一次生成數萬乃至百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，作為數字 PCR 的樣品分散載體。這裡，液滴中包裹了單拷貝DNA模板和PCR反應液，然後將液滴收集在PCR反應管中進行擴增。?PCR反應結束後檢測每個微滴的熒光信號。

目前Bio-Rad公司的QX100系統、QX200系統均為採用液滴技術的數字PCR系統。

圖6. Bio-Rad的droplet digital PCR系統

5.2 微陣列晶元式PCR

微陣列晶元式PCR主要通過晶元設計將納升液體封閉在高通量的微池或微量通道中進行後續的PCR擴增及擴增後結果的熒光顯微鏡直接判讀。

按晶元設計方式，微陣列晶元式PCR又可以分為陣列微池式晶元、滑片式晶元和集成微泵閥晶元：

1.陣列微池式晶元上刻蝕有微池陣列，反應液由進樣孔直接導入個反應微池；

2.滑片式晶元是設計帶有微流體通道和反應單元的玻璃晶元，上下兩篇玻璃晶元間用油相密封，通過滑動晶元將樣品溶液從液體通道引入反應單元，同時生成成百上千個微反應滴陣列；

3.集成微泵閥式晶元是通過多層軟刻蝕技術在聚二甲基硅氧烷（PDMS）晶元上加工交織的液體和氣體通道結構，通過精確地控制微泵閥的開啟和關閉，快速並準確地將流體分成若干個陣列的獨立單元。

2010年，Life Technologies也推出了基於陣列微池式晶元的數字PCR產品線–OpenArray系統。它提供的TaqMan OpenArray 數字PCR試劑盒可在OpenArray平板上運行。平板可在現有的OpenArray 實時定量PCR系統以及新上市的QuantStudio 12K Flex儀器上運行。OpenArray 實時定量PCR系統能夠同時運行3塊OpenArray平板。

圖7. TaqMan OpenArray Digital PCR系統

Fluidigm公司於2006年底推出了基於集成流體通路（IFC）晶元的Bio-Mark 高通量基因剖析系統。

其創新在於集成液體通路技術：應用集成電路製造工藝（光刻）在矽片或石英玻璃上刻上許多微管和微腔體，經過不同的控制閥門控制溶液在其中的活動來完成生物樣品的分液、混合、PCR擴增。

圖8. Bio -Mark IFC晶元

來源：體外診斷網

作者：湯明輝 香港中文大學電子工程系微流控方向在讀博士。

2010-2014：南京大學光電信息工程系本科；2014至今：香港中文大學電子工程系碩博。

博士期間以離心微流控平台為載體，研究基於微流控的全自動化體外診斷儀器設備。研究重點在於基於微流控技術的全自動化的分子診斷系統和基於微流控技術的全自動化的葯敏試驗系統；當下也重點關注基於微流控的化學發光系統，基於CTC的液體活檢技術和digital PCR技術；研究核心在於微流控晶元的設計與整個系統的搭建。

知乎賬號：湯明輝（更多微流控內容，歡迎關注知乎賬號）。

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