發酵工程師進階教程：生物效價測量綜述

引言

生物效價檢測主要提供了藥品生物活性的信息(與臨床療效一致)，目前主要應用於生化藥物、生物製品領域，這類藥物的主要活性成分有氨基酸、肽、蛋白質、酶、多糖、脂類、核酸，部分藥物由動物臟器、微生物等提取製成或是生物技術藥物，其活性成分不明確，結構複雜多變；空間結構的細微變化，都會影響藥物的活性中心位點，因此採用生物效價檢測作為評估這類藥物活性的手段具有獨特的優勢，從發現新葯、新葯研究，到生產中試、工藝驗證、終產品質量控制，生物效價檢測都貫穿其中。

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1、 生物效價含義

生物效價檢測是以藥理為基礎，生物統計為工具，運用特定的實驗設計，利用生物體在一定條件下比較供試品與相當的標準品或對照品所產生的特定反應(可測定、量化生理指標或生物學特性的變化)，來測定藥物生物活性(藥效、活力或毒力)的一種定量的方法，因而亦被稱為定量藥理學。

2 、 檢測方法分類

生物效價檢測可分為體內檢測(in vivo)和體外檢測(in vitro)兩種途徑。體內檢測是以整體動物為生物體，能反映藥物對人體的作用方式，是最經典的生物效價檢測方法，因此中、外藥典在重組人生長激素(rhGH)、重組人胰高血糖素的工藝驗證要求必須用體內測定法測定其生物效價。體外檢測的方法常規有以管碟法和比濁法。

3.檢測方法選用標準

生物效價檢測方法的選取應遵循「相關性、重複性、靈敏性、適用性和定性定量」的原則。「相關性」是指所選取的檢測方法應與藥物的功能主治或現代藥理作用有關，從而保證檢測結果與臨床療效的相關性。「重複性」是指在嚴格規定的條件下，檢測結果應有一定的重複性，以保證試驗的延續性和可重複性；「靈敏性」是指所選取的檢測指標能客觀體現反應程度隨劑量的變化而有顯著的改變；重複性和靈敏性要求不能等同於理化檢測中的要求，而是生物統計學的角度來評價方法是否具有重複性和靈敏性。「適用性」是指選取的檢測方法應快速、高效、通用性好、易於推廣。

4、管碟法測定生物效價的影響因素

4.1、試驗菌對效價測定的影響探討及改進

試驗菌傳代和保存的舊方法是將冷凍管菌種復甦後, 採用斜面低溫保藏法, 一般1 ～ 3個月轉種一次, 每6 代平板分離一次, 挑選典型的單個菌落擴大培養, 繼續使用, 缺點是抑菌圈清晰度逐漸變差, 導致平均可信限率偏高, 有些抗生素品種的抑菌圈直徑逐漸偏小, 需要做較多的工作才能有效的控制。

4.2培養基對效價測定的影響探討及改進

培養基有乾粉培養基和自配培養基兩種。乾粉培養基即購買的半成品乾粉培養基, 按比例加入水中混勻滅菌, 使用方便。但有時會不適合本公司使用, 如鹽酸大觀黴素, 若用乾粉培養基Ⅱ測定效價,抑菌圈清晰度差, 儀器測量較困難。因此可以選擇自配培養基。

4.3培養基中瓊脂對效價測定的影響

探討及改進瓊脂在培養基中起凝固作用, 控制好瓊脂的質量和含量, 能保證抑菌圈邊緣的清晰度, 有效地控制平均可信限率和抑菌圈大小。所以要選擇合適的生產廠家, 來保證質量, 使配製的培養基凝固後透明無沉澱。同時控制好瓊脂含量, 試驗發現, 瓊脂含量應控制在最低限度, 即控制在小鋼管不下陷為準。這樣在加菌層培養基時粘度適中, 不容易結塊, 攤布均勻, 形成的抑菌圈均勻度好。

4.4 溶液配製對效價測定的影響

（1）使用的標準品與供試品必須同質, 要注意多組分抗生素標準品與供試品的組分比應相同, 盡量避免使用不相同組分進行比較, 否則標準品與供試品的兩條反應直線不平行, 計算結果時出現誤差較大。（2）配製標準品溶液和供試品溶液時, 應按標準操作規範, 並注意所用劑量器具必須是A級品,按其要求進行標定後才能使用。標準品與供試品所用溶劑盡量相同, 使用同一瓶緩衝液, 用同一支吸管、吸取相同的體積、同時進行稀釋, 使標準品和供試品的測定條件盡量一致, 抵消各種誤差, 將操作誤差降低到最低限度。否則也會影響標準品與供試品兩條直線間的平行, 影響測定結果的精密度和準確度。

4.5培養溫度對效價測定的影響

在實際操作中發現, 培養溫度對有些產品抑菌圈清晰度影響很大, 導致可信限率偏高

4.6培養時間對效價測定的影響

培養時間會影響抑菌圈的清晰度, 導致可信限率偏高。

4.7 測量儀對效價測定的影響

測量儀的精密度和準確度是十分重要, 否則得不到真實的測定結果。所以要正確使用測量儀, 測量前要調整好抑菌圈圖象的清晰度, 再按要求進行測量。

5、高通量生物效價測定方法

譚俊在《比濁法測定紅霉素生物效價及其高通量測定方法探討》一文中指出：以96孔板為檢定菌培養容器，以酶標儀為檢測儀器，基於抗生素比濁法原理測定紅霉素效價。與管碟法相比，微量比濁法實現了「快速」；與常規比濁法相比，微量比濁法實現了「高效」。該方法可以應用於研究開發抗微生物抗生素的大規模初篩階段；生產菌種高產菌株的高通量篩選；發酵、分離純化、原料葯檢驗與抗生素合成等生產過程監控；含抗生素藥品食品檢驗中的快速規模化分析；環境監控中抗生素含很小，即96孔板可用於微量比濁法。

常規比濁法培養檢定菌、微量比濁法測定紅霉素發酵液為檢測對象，常規方法培養檢定菌，微量比量的快速分析，該方法稍作改動同樣可以用於上述領域的含維生素樣品分析，如維生素，B12 等的檢測。

結尾

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