酸鹼度敏感的Smad5發現之旅

BioArt按：7月4日，同濟大學附屬第十人民醫院、同濟大學醫學院章小清教授課題組在Cell Research雜誌在線發表了題為「Smad5 acts as an intracellular pH messenger and maintains bioenergetic homeostasis」的研究論文，首次揭示了Smad5存在不依賴於傳統BMP信號的一個全新重要功能，這也是第一個發現細胞是如何回應外界環境變化，並通過捕捉胞內酸鹼度的變化以維持細胞內代謝穩態的重要細胞學事件（詳見BioArt此前的報道：同濟大學章小清組創新性研究揭示Smad5感受細胞內酸鹼度的新功能丨BioArt特別推薦）。鑒於該研究的創新性與重要意義，BioArt特別邀請到了這篇論文的第一作者、同濟大學醫學院章小清教授組的博士研究生房玉江撰寫這項研究的「發現之旅」，講述科學研究背後鮮為人知的故事。事實上，往往許多創新研究發現的背後故事更應該值得大家深思，科學探索美妙歷程也會給大家以啟發。靜靜地讀完這篇「心路歷程」，或許讀者們會有不一樣的感悟與體會，或許你也會重新審視一些無法解釋實驗結果，或許重大發現就在手中等待你去深入發掘。欣賞結果的同時，也許我們也應該注重發掘論文發表背後的故事。

撰文丨房玉江（同濟大學醫學院博士生）

光陰荏苒，從2011年發現Smad5低溫出核現象到現在文章發表已6年有餘，自己也從一個科研門外漢漸漸成長為一名相對成熟的科研人員。回首這些年的研究生涯，體會到科研帶來的種種酸甜苦辣，同時又覺得自己很幸運的發現了一個非常神奇的酸鹼度敏感蛋白。

記得當時我的導師章小清教授回國還不到1年時間，細胞培養室投入使用也不長時間。我們最初的設想是研究TGFβ及BMP信號通路在人胚胎幹細胞維持與分化中的作用。通過慢病毒感染的方法，我們建立了表達GFP-Smad1-8融合蛋白的人胚胎幹細胞系。當時剛接觸細胞培養，在熒光顯微鏡下觀察到熒光蛋白覺得很神奇。

早上很早來到實驗室，在熒光顯微鏡下觀察剛構建好的GFP-Smads蛋白的熒光分布。因為有幾種細胞系，等輪到觀察過表達GFP-Smad5細胞時，已經過了十幾分鐘，當時觀察到GFP-Smad5蛋白完全位於細胞質中。等章老師到實驗室後，他親自帶我們去觀察細胞的表型。不可思議的是，他觀察到的GFP-Smad5竟然大部分位於細胞核內，我就去跟章老師說我剛才觀察到的GFP-Smad5蛋白是分布在細胞質的。章老師沒有武斷的說我觀察的有問題，而是秉持了科學家求真務實的精神，說我們將細胞放在顯微鏡下不動，等過15分鐘再來觀察。15分鐘後，GFP-Smad5竟神奇的跑到細胞質中。當時覺得這是一個很神奇的現象，這也激發了我對科研的興趣。

但接下來探索它的功能方面就很艱辛了，因為人是恆溫動物，體溫維持基本的恆定，那為什麼會存在感受溫度變化的蛋白呢？我們考慮到皮膚與外界環境直接接觸，是否與表皮角質細胞或毛囊幹細胞的分化有關呢？於是我們在新生小鼠的皮下注射GFP-Smad5過表達病毒，看是否會促進小鼠角質層的生長；還分離培養過人的毛囊幹細胞，觀察是否會促進它的分化。另外，考慮到溫度對魚卵發育具有決定作用，還加入Smad5蛋白的出核抑制劑，觀察對斑馬魚卵發育的影響。不幸的是，這些實驗都失敗了，都沒有觀察到它的功能。在功能實驗相繼失敗後，我們思考發現一個溫度敏感蛋白可能是一個重要的細胞學現象，2012年時曾經試圖投稿，但是都相繼敗北。

投稿失利後，我們想知道是否還有其它因素能調控Smad5的核漿分布。於是，我們在培養液中加入改變胞外酸鹼度、滲透壓、氧自由基、膜電位及不同信號的調控小分子。我們驚奇的發現，Smad5還可以感受細胞外酸鹼度及滲透壓的變化。進一步研究發現，溫度、胞外酸鹼度及滲透壓都可以改變細胞內酸鹼度，Smad5可以快速感受細胞內酸鹼度的變化進而引起其核漿分布的改變。在找到感受胞內酸鹼度的結構域與氨基酸位點，解析了這是Smad5一個全新的不依賴於經典BMP信號的性狀後，2013年我們進行了新一輪投稿。不幸的是，還是由於缺乏功能，未獲成功。

接下來，我們重新審視我們的工作，認為應當全力尋找這一現象的生物學意義。由於Smad5基因敲除的小鼠早期胚胎致死，我們沒有辦法通過動物模型研究功能。由於當時以TALEN為代表的基因編輯技術取得突破，我們很快通過借鑒這一技術獲得了敲除Smad5的人胚胎幹細胞系。通過比較野生型和Smad5敲除的人胚胎幹細胞轉錄組，我們獲得了Smad5可能調控代謝的重要線索。後面就開始了整整3年的功能驗證與分子機制解析的過程。由於實驗室主要聚焦於神經分化和神經發育，在代謝方面的研究缺乏相應基礎。代謝產物的檢測、酶活性分析、線粒體純化、電鏡、免疫共沉澱結合質譜尋找結合蛋白等新的實驗手段，需要去不停查閱文獻、尋求合作和接受失敗的洗禮。我們最終確認了生理功能並通過分子機制進行了佐證，並完成了投稿。這距上次投稿又過了3年多，由於之前文章投過多次，而且投到兩個主流期刊後都出現一個多月不送審的特殊情況，期間也很擔心文章會被別人搶發，還好，一切等待都是值得的。

也許科研之路就是如此，一切都是未知的，也沒有前人的經驗可以借鑒，只能摸著石頭過河，不停的嘗試與探索。很多時候都懷疑這個課題可能完成不了，但慶幸的是，自己沒有放棄，堅持了下來，慢慢對Smad5的功能及機制都有了一些認識。科研之路充滿艱辛與挑戰，有屢敗屢戰的迷茫與痛苦，也有偶然成功的欣喜，但我們要懷著滿腔熱情，一路執著跋涉，沿途的失敗與成功會交織成最值得回憶的風景。

寫個後記與廣大研究生朋友共勉。

BioArt後記：如果讀者朋友讀完這篇文章後覺得這樣類型的文章很好，您不妨點個贊留個言，BioArt今後將會更多的推出這類文章以饗讀者！

致謝：感謝同濟大學章小清教授和高正良教授對BioArt的支持！

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