新手指南：如何搞定幹細胞的低溫保存

不論你用幹細胞做什麼研究，都離不開低溫保存。冷凍可以保存珍貴的幹細胞資源，不過冷凍幹細胞可不像冷凍已分化細胞那麼簡單。我們不能簡單沿用普通細胞的冷凍試劑和方案。

在過去十年里，多能幹細胞成為了多個領域的實用工具，幫助人們探索發育生物學、研究疾病病理和開發細胞療法。

不論你用幹細胞做什麼研究，都離不開低溫保存。冷凍可以保存珍貴的幹細胞資源，不過冷凍幹細胞可不像冷凍已分化細胞那麼簡單。我們不能簡單沿用普通細胞的冷凍試劑和方案。

科學家們一開始對人胚胎幹細胞進行操作時發現，一次凍融循環之後只有5%的細胞還具有多能性。這是因為壓力條件會促使細胞發生分化，Fraunhofer細胞療法和免疫研究所的Alexandra Stolzing說，「如果保存的幹細胞發生了隨機分化，就沒有價值了。」

另外，冷凍還會激活一個程序性死亡通路，而且在絕大多數情況下添加凋亡抑製劑收效甚微。科學家們一直在試圖理解，低溫究竟對多能幹細胞產生了什麼影響，希望在此基礎上開發更好的冷凍方法，讓更多細胞存活下來。

應該用什麼來冷凍幹細胞？

這個問題的答案取決於你的細胞系，不過大多數成功的冷凍方案也有一些共同點。人們一般先用蛋白酶來解離細胞，然後進行離心，最後用含有冷凍保護劑的培養基重懸。經典的冷凍保存培養基，由90%的胎牛血清（FBS）和10%的DMSO組成，DMSO可幫助細胞抵禦冷凍帶來的有害影響。但是如果你的細胞要用於人體，上述試劑就不合適了，它們可能有毒會帶來副作用。此外，使用90 FBS/10 DMSO混合物時，細胞復甦之後的活性往往較差。近來，研究者們紛紛開始使用無動物源成份的試劑，以及更低濃度的DMSO。Caspase抑製劑常被用來避免細胞凋亡。

今年早些時候，RIKEN發育生物學中心的Teruo Akuta等人比較了不同的低溫保存方案和試劑，為自己的胚胎幹細胞和誘導多能幹細胞確定理想的培養基。他們發現，在冷凍前用鏈霉蛋白酶和螯和劑EDTA處理，可以提高幹細胞的復甦率。Akuta指出，幹細胞喜歡抱團生長，但冷凍保護劑難以浸透較大的細胞團塊，用鏈霉蛋白酶和螯和劑EDTA可以將細胞分成大小均一的小簇。Akuta團隊還改良了商業化的低溫保護劑CP-1，CP-1含有羥乙基澱粉（植物源的冷凍保護劑）和DMSO。他們通過添加人血清白蛋白和乙二醇，進一步提高了培養基的效力。研究顯示，添加乙二醇時的復甦效率最高，有活力的細胞佔到44%。不過，這樣的組合併不一定適用於任何人。（延伸閱讀：Science：iPS臨床應用這次真的來了？）

「並沒有所謂的最佳冷凍保護劑，」牛津大學的Zhanfeng Cui說。他建議新手們嘗試不同試劑，查閱用到了相同細胞系的文獻。許多人直接把細胞放在10% 的DMSO里冷凍，然後等著出現好結果。「花幾個小時查文獻，就能為你節省大量的時間，」他指出。「培養幹細胞是個高成本又費時的過程，我們要儘可能的保護資源。」

冷凍的速度重要麼？

絕大多數低溫保存方案是，先將樣本放在–80 °C冰箱過夜，第二天再轉移到液氮進行長期儲存。有研究發現，使用程序性的冷凍方法能獲得更好的結果。這種方法通過特殊設備，控制樣本溫度以穩定速度降低（每分鐘幾度）。不過就算你沒有這樣的設備也不必灰心，因為也有文章認為最終的細胞產量並沒有太大差異。

現在還出現了一種新興的冷凍方法，即玻璃化（vitrification）。玻璃化是指通過超快速冷卻，形成糖漿一般的液態而不是結晶的固態。這種方法能避免形成冰晶，但需要高濃度的冷凍保護劑和特殊的設備。

「還是那句話，要反覆嘗試才能找到最適合自己細胞的方案，」 Stolzing說。如果你只有–80度低溫冰箱，那麼就試著優化培養基提高產量。如果有條件，控制冷卻速度和玻璃化冷凍都很值得一試。

應該如何復甦幹細胞？

在理論上，細胞在–196 °C的液氮中可以穩定存在很多年。激活細胞死亡和分化通路的是冷凍和復甦過程。因此，復甦幹細胞的時機完全取決於你自身的需要。冷凍過程需要慢而穩，而細胞復甦要很快。

「對於細胞復甦而言，速度是很有必要的，」Stolzing說。「現在大家都在追求快速復甦。」

幹細胞的試管可以放在37°C水浴中解凍，然後用生長培養基重懸。如果想除去DMSO，還可以洗幾個循環。細胞復甦之後，最好用幾天時間來培養，篩查它們的功能是否正常。

我能得到怎樣的產量？

如果幸運的話（你的幹細胞系特別有活力），第一次進行凍融可能會得到40%、50%甚至更高的產量。但是如果你的產量只有10%左右甚至更低，也完全用不著驚訝。方法的優化往往需要多次嘗試，Cui說。

另外計算產量不要操之過急，佛羅里達州立大學的Yan Li提醒到。「最初的細胞活力可能有誤導性，」她說。「細胞解凍之後有時要過一會兒才開始死亡，你可能會最終失去植板的細胞。」研究顯示，細胞死亡在植板後大約24小時達到高峰，因此最好等一等再來計算產量。

復甦後的細胞還是幹細胞么？

「對於幹細胞而言，復甦得到活細胞並不是我們的最終目標，」Cui說。「關鍵問題是，這些細胞是否喪失了多能性。」除了在顯微鏡下分析形態，觀察細胞植板後的生長模式，他還建議在凍融循環前後用相應標記（例如Oct-4）進行染色。這樣我們就能夠了解幹細胞的分化情況。在細胞復甦後，也可以通過商業化晶元來檢測拷貝數變異、表觀遺傳學改變和染色體畸變。

復甦的產量低沒什麼大問題，我們只需要培養更多細胞就行。但是我們不能假定存活下來的細胞與原始細胞相同，特別是在產量很低的情況下。「存活下來的細胞可能經過了某種選擇，」 Cui說。「我們正在嘗試理解這個問題。」

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