轉錄因子JunB通過SQSTM1調控NF-kB依賴炎症反應

1.JunB功能缺失促進角化細胞增殖，但是降低屏障功能

轉錄因子JunB缺陷的小鼠表現出牛皮癬樣的炎症，作者對該現象中JunB發揮作用的機制進行了探究。

首先為了了解JunB在皮膚中的作用，作者通過siRNA沉默JunB，研究JunB功能缺失對錶皮生長和細胞屏障功能的影響。發現JunB沉默組有更高的細胞增殖比例。在含有TNFα的培養基中培養細胞（TNFα可以抑制角化細胞生長），發現JunB敲除能夠削弱TNFα對細胞生長的抑制效應。通過上皮細胞的跨膜電阻(trans-epithelial resistance,TER)來評估JunB對細胞屏障功能的影響，TER越高說明屏障效果越強，JunB敲除後24小時和48小時，TER明顯降低，表明JunB對於表皮細胞的屏障功能是非常重要的。

作者在角化細胞中過表達或者沉默JunB，通過Ki-67的免疫染色來評估對細胞生長的影響，發現JunB的過表達顯著抑制細胞增殖，但是JunB突變敲除（DNJunB）誘導了輕微的細胞生長的增加，這些結果表明JunB涉及到了控制表皮細胞增殖和屏障功能。

2.RNA-seq分析揭示了JunB在調節表皮炎症和細胞粘附性中的重要作用

為了研究JunB如何調節表皮自穩態，作者對JunB沉默的原代人角化細胞和正常角化細胞進行RNA-seq尋找差異表達基因，在顯著上調的基因中注釋到自穩態和炎症相關的功能的基因，包括SQSTM1， TNFα，CXCL10，CCL2，IL6R。

RT-PCR和培養基中細胞因子檢測也證實了上述基因在JunB敲除後表達上調。

3. ChIP-seq發現SQSTM1是JunB的直接作用靶點

接著，作者使用ChIP-seq方法尋找JunB的直接作用靶點。結果顯示在5號染色體上基因SQSTM1的轉錄起始位點（TSS）上游1.8kB有一個結合峰，SQSTM1編碼一個對NF-kB激活和自噬非常重要的蛋白。同時在該基因的啟動子區域富集了H3K27Ac修飾，它是活性增強子的標誌。同時，Motif分析發現激活蛋白-1（AP-1）的保守元件（TGACTCA）表現出很高的置信度，表明JunB的ChIP實現了在AP-1保守區域的成功富集。由此作者猜測在SQSTM1的啟動子區域存在AP-1響應元件，故作者用AP-1反式元件的引物進行ChIP-PCR驗證，同時為了進一步證實AP-1反式作用元件的重要性，進行luciferase報告基因分析，發現JunB抑制了基因表達，綜上，JunB通過AP-1反式元件調控SQSTM1的表達。

4. SQSTM1介導了趨化因子的表達

作者推測SQSTM1參與了介導炎症細胞因子的上調。為了證實這一觀點，作者在已經證實JunB的基因沉默會導致SQSTM1的蛋白水平上調的基礎上，對SQSTM1進行敲除和過表達，qPCR發現SQSTM1過表達會增加CXCL10和CCL2的mRNA水平；相反，SQSTM1的基因沉默阻斷了由JunB降低引起的對趨化因子的誘導作用。這些結果表明SQSTM1對趨化因子的表達起到正調控作用。

5. NF-kB對於CCL2和CXCL10的誘導作用是必不可少的

已知SQSTM1是NF-kB激活的關鍵調節子，作者推測NF-kB對於細胞因子的表達上調是必不可少的。JunB的沉默誘導NF-kB激活，由IkBα突變引起的NF-kB沉默阻斷了SQSTM1對CXCL10的誘導作用，為了進一步檢測NF-kB對細胞因子的表達是否是必需，作者用NF-kB抑製劑PDTC處理細胞，條件培養基被收集並用於分析細胞因子，發現PDTC處理會顯著降低促炎症細胞因子CCL2和CXCL10的蛋白水平；相似的是，NF-kB突變也會顯著降低TNFα,CCL2和CXCL10的表達，相比之下，IL6R沒有受到NF-kB突變影響。這些發現表明NF-kB對於促炎症細胞因子的誘導是必不可少的。

6.總結

JunB的功能紊亂導致SQSTM1的表達上調，誘導NF-kB依賴的促炎症細胞因子的表達。此外，JunB功能缺失通過直接和間接的靶基因調節促進了細胞增殖，降低了細胞屏障功能。進一步需要做的是促炎細胞因子是否是間接影響了細胞增殖和屏障功能。

參考文獻：Zhang X, Jin J Y, Wu J, et al. RNA-Seq and ChIP-Seq Reveal SQSTM1[sol]p62 as a Key Mediator of JunB Suppression of NF-[kappa]B-Dependent Inflammation[J]. Journal of Investigative Dermatology, 2014, 135(4):1016-24.

文章中使用的ChIP-seq、RNA-seq技術都是康測擅長的。

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