生化檢驗並不是你想的那麼簡單！

作者：山東中醫藥大學附屬醫院 遲小偉

生化檢驗是醫學檢驗重要的一部分，其特點是定量檢測。是否使用了先進的儀器設備、合格的試劑、有資質的人員就能做好生化項目檢驗？多數情況下是肯定的，但實際工作中還會出現這樣那樣的失控，甚至不得其解。這需要我們多總結遇到的問題，研究項目的原理，做工作中的有心人，才能不斷提高檢驗水平。

一、標本及時分離與測定

標本的及時分離及測定是體現樣本真實結果的重要保證。利用NADH轉化為NAD 變化率來檢測其物質含量的試驗都或多或少受到血液存放時間的影響。原因是全血存放時間越長，紅細胞利用血清中的糖進行無氧酵解產生丙酮酸，丙酮酸使NADH轉化為NAD ，這樣使測定結果假性升高，如ALT、AST、BUN、CK、LDH、HBDH等。此外，由於糖酵解，血中GLU隨著存放時間的延長約以5-7%/小時的速度降低。因此，一定要作好與臨床的溝通，對抽血和標本運送人員進行培訓；收到標本後及時分離血清並檢測；也可將全自動生化分析儀上的延遲時間設置大於60秒，這樣試劑在延遲期內消除丙酮酸的干擾，可完全避免假陽性結果的出現。

二、抗凝劑的使用

目前臨床上常用的抗凝劑有EDTA-2K、肝素、枸鹽酸鈉等，TBA和AFU不能用肝素抗凝劑，因為肝素會使TBA和AFU試劑發生混濁，導致吸光度假性偏高，從而使檢測結果偏高。所以認真參閱試劑說明書，按照要求採集正確標本。

三、儀器用水

合格的儀器用水是保證生化結果的一個重要環節。測定離子類的項目：比如銅、鐵、鋅、鈣、鎂、磷，在使用過程中，儀器用水的質量相當重要，雖然現在一般醫院的生化儀都帶有制水系統，但制水系統基本都是製備去離子水，離子交換樹脂在使用一段時間後交換能力明顯下降，需要定期進行更換，否則製備的水離子含量多，電導率偏高。使用含離子超標的水沖洗儀器，直接影響檢驗結果。再如血氨、二氧化碳項目，如果水質不好，儀器用水中本身含氨和二氧化碳就很高，則檢測該項目的結果也會受到嚴重的影響。如果血清中含有GLDH，而儀器用水存在氨時，可消耗NADH，使利用NADH的酶聯連續監測法結果偏高。所以需要定期監測水質，當儀器用水的電阻小於1．0M?時要及時更換離子交換樹脂或活性炭。

四、交叉污染

在使用全自動生化分析儀的過程中，可能會遇到這樣的情況：單獨做某個項目時結果沒有問題，可是將它與某些項目組合在一起時，結果卻出現異常。這種現象首先就要考慮交叉污染。交叉污染是在生化分析儀中比較常見的現象，其中的原因是全自動生化分析儀的清洗系統隨著儀器使用時間的累加，清洗效果逐漸下降，試劑交叉污染的程度增加所致。全自動生化分析儀各試劑間的相互干擾影響到了檢驗結果的準確性和可靠性，給檢驗結果帶來很大的偏差。只要我們找出其中的規律，就可以避免這種情況的發生。以下兩種情況較為多見：

（1） 生化分析儀清洗問題造成的交叉污染

生化分析儀的交叉污染主要來源於：樣品針、試劑針、攪拌棒和比色杯。由於全自動生化分析儀試劑針需要接觸各種試劑，一般難以徹底清洗乾淨，所以容易造成分析項目的攜帶污染．而生化項目的測定往往僅需要幾微升樣本，試劑往往需要幾百微升，尤其在沒有自動沖洗程序的流動池式生化分析儀上，由於前帶現象的存在，如果前一個樣本為高值樣本，則接後的第一個低值標本結果應慎重報告。不僅沒有沖洗程序的生化分析儀器上有這種現象，就是具有自動沖洗程序的全自動生化分析儀也有交叉污染。另一個值得注意的問題是許多生化儀器由於長期頻繁的利用，加樣針和試劑針的注射器磨損加重、注射器的「特氟龍」吸頭不及時更換等原因，使吸樣針或試劑針密封層增大，產生泄漏現象也是造成樣本間及試劑間相互污染的一個重要原因。試劑吸樣或樣品吸樣不準確，通常導致利用速率法測試的標本系統偏低或偏高。速率法計算因子是由加樣體積和試劑體積參與確定的，如果加樣體積或加試劑體積不準，導致真正速率計算因子和理論計算因子偏離，從而使檢測結果不準確。此外，還有攪拌棒塗層出現破損、比色杯磨損或沖洗泵故障等引起的結果偏差。為避免上述交叉污染出現，需按照要求定期進行儀器維護保養，及時更換零部件，並定期對儀器進行校準。

（2）檢驗項目間的交叉污染

一個項目會影響緊隨其後項目的測試結果，造成這種影響的原因是前者試劑中含有後者試驗的測定物質而直接干擾其測試結果；或者前者試劑中含有改變後者試驗反應條件或影響其反應進程的物質而間接干擾其測試結果。例如，在TP試劑中含有大量的CuSO4，如果將Cu放在TP項目的後面檢測，會使檢測結果偏高或重複性差。P放在含有磷酸鹽的項目後面，TBA放在含有膽酸鹽的項目後面，如CH，都會使檢測結果偏高或重複性差。GLU放在CK和CK—MB的項目後面可能會使檢測結果偏高或重複性差。原因是CK（NAC-activated）、CK-MB（NAC-activated）試劑中含有Glu成分，其分析方法的原理中包含Glu的已糖激酶(HK)反應過程，因此可能對Glu測定帶來干擾，尤其對Glu的HK法測定可能帶來嚴重干擾。此外，相鄰兩個項目的PH值相差太大或對PH要求嚴格的項目，也會對測定的結果產生影響，比如TP和Alb之間PH相差較大，會互相干擾，TBA放在Alb後面測定，會使測定結果偏低。大多數酶反應pH值在6.0-7.5之間；ALP、γ-GT、LDH須在鹼性條件下最適宜。解決此類交叉污染，需要了解項目試劑組成、反應的原理、所需的條件，來調整合適的實驗順序；在造成污染的項目和受污染的項目之間設置加強清洗。

五、試劑使用

（1）正確設置參數

生化分析儀上通常有分析程序供用戶設定，包括樣品量、試劑量、波長、分析方式和延遲時間、測試時間等。下面就延遲時間和加樣程序的設定來說明如何正確使用分析參數。以肌酐苦味酸測定法為例，苦味酸在鹼性條件下50秒前首先快速與如乙醯乙酸等快反應物質產生紅色化合物，而在120秒後鹼性苦味酸又能與慢反應物質產生陽性干擾，所以延遲時間最好設定為50～6O秒之間，測定時間小於6O秒，這樣就充分消除了快反應和慢反應干擾，從而檢測到真正肌酐含量。此外，試劑說明書中關於參數的設置是經過廠家驗證合理有效的，但仍需根據本實驗室條件、儀器狀態和樣本結果進行綜合觀察，可以做適當調整以達到適合本實驗室的檢測要求。

（2）校準液的使用

目前生產廠家提供的校準液只適用於某一特定的分析系統，同一項目不同方法學的校準液不能混用，比如膽紅素釩酸鹽法用重氮法的校準液校準，TBA循環酶法用比色法校準液校準等都會造成測定結果不準確。甚至同一方法學，不同廠家的校準品和試劑都會有所差異。所以建議選擇適合自已實驗室的校準品，與理論計算的factor值差異不大，沒有發現有明顯的影響因素，如有條件可進行系統溯源。在實現溯源性目標過程中，以患者新鮮標本為實驗對象，以方法學對比試驗為驗證手段。

（3）開瓶穩定性

開瓶穩定性也是檢驗試劑質量是否過硬的一個指標。目前就某些項目的方法學來講，還達不到人們所要求的試劑開瓶後在儀器內放很長時間不需要定標，比如ALP、TP、GSP等PH為鹼性的試劑，開瓶後試劑會吸收空氣中的二氧化碳，使試劑本身的PH值下降，如果長時間開瓶不定標或校準，會使檢測結果發生偏離，有些實驗室為了方便，很長時間都不作校準，導致測定結果的不準確。所以上機試劑量要根據本實驗室的標本量來定，放置1～2天的用量即可，試劑瓶在儀器內使用時間不要過長，及時更換。根據試劑特性，及時對項目進行校準。

（4）不同批號試劑相混

將不同批號的試劑混合在一起使用的現象在工作中經常發生，但是由於不同批號的試劑生產時間不同，試劑中工具酶的活性會有差異，會發生水解的底物濃度隨時間長短也會不同。因此混在一起使用而又不定標，可能會導致檢測結果的不準確。還有如果有的試劑開瓶時間太長，空氣中的灰塵或細菌會進入瓶中，由於有的試劑含有大量的蛋白質和鹽，是細菌生長的最好條件，雖然有的試劑添加了防腐劑，但防腐劑的防腐也是有一定限度的，而且絕大多數廠家的試劑中是沒有防腐劑的。所以建議不同批號試劑不要混用，如果混用最好重新定標；多個試劑瓶剩餘不同批號的試劑，可以留起來待一定數量後混在一起，然後重新定標後使用。

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