CAR-T療法關鍵：如何低成本高質量的工業化生產

今天是2017年9月1日

農曆七月十一

醫麥客：CAR-T迎來井噴式收穫

2017年9月1日/醫麥客 eMedClub/--最近這段時間，小編真真的感受到連空氣里都瀰漫著一股燒焦了的CAR-T細胞的味道。從諾華CTL-019獲得FDA專家委員會全票推薦到Gilead以119億美元現金收購CAR-T治療公司Kite Pharma，再到昨天首個CAR-T細胞藥物獲批上市的超級重磅。媒體頭條連番轟炸，整個醫藥行業對CAR-T療法的熱情更是持續高漲。

CAR-T治療過程

視頻來源 STEMCELL官網

https://v.qq.com/x/page/j0543fv6ami.html

許多在細胞療法領域耕耘多年的生物技術新銳也在今年迎來了井噴式的收穫，諸多CAR-T療法顯示出了大量喜人數據。使得原本無葯可治的患者，生命之火得以重新點燃。至此，CAR-T絕對可以稱得上是一種革命性的治療手段。

作為細胞療法的代表，CAR-T療法(嵌合抗原受體T細胞)的特別之處在於給T細胞安裝了一個能夠特異性識別腫瘤表面抗原的導彈定位系統CAR(嵌合抗原受體)，然後把這種經過修飾改造的T細胞重新輸回到患者體內，而這些受體能引導T細胞進攻癌細胞，從而對後者造成殺傷。

CAR-T細胞製造過程(圖片來源sec.gov)

當然這是非常簡單化的說法，事實上，這種個性化的治療方法的困難指數並不低。不同於傳統藥物，每個批次都是針對特定患者設計的，而且過程中涉及到基因工程和活細胞，需要經過培訓的專業技術人員來完成，質量控制檢測更是貫穿於整個過程。

分離出T細胞

抽取癌症患者的外周血，採用白細胞分離術對T細胞進行富集，淋巴細胞的富集可以通過密度梯度離心法完成，此法根據細胞的大小和密度分離，並保持細胞活力。T細胞亞群的分離通過CD4/CD8特異性抗體或者表面標記偶聯磁珠進行分離。而為了能夠更加高效的激活T細胞，則可以利用CD3/CD28單克隆抗體磁珠。

Activation of T cells in Nature and in Expansion Platforms(圖片來源 ProMab Biotechnologies)

例如ProMab Biotechnologies公司的CD3/CD28 T CELL ACTIVATION/EXPANSION BEADS，該項技術提供了活化和擴增T細胞的簡單方法，無需抗原呈遞細胞或抗原。CD3/CD28 TCELL ACTIVATION/EXPANSION BEADS是一種大小約為3.0μm的抗體偶聯磁珠，其表面結合CD3和CD28 單克隆抗體的複合物。使得磁珠可以提供T細胞活化和擴增所需的主要和協同刺激信號。該產品擁有與國際其他品牌一致的刺激效果和更低的成本。

使T細胞成為CAR-T

利用基因工程技術給T細胞加入一個能識別腫瘤細胞，並且同時激活T細胞殺死腫瘤細胞的嵌合抗體(CAR)，使之成為CAR-T細胞。簡單來說CAR-T技術就如同給T細胞裝上了GPS導航系統，能識別癌細胞，並進行殺傷，成為免疫軍團中的「超級特戰隊」。

Transduction efficiencyof CAR-T cells expanded with Company A and ProMab』s CD28/CD3 beads. CAR-T cellshad >70% transduction efficiency when expanded with ProMab』s beads asdetected by flow cytometry after staining cells with FAB antibody(圖片來源ProMab Biotechnologies)

目前，研究人員主要通過γ-逆轉錄病毒、慢病毒、睡美人(Sleeping Beauty)轉座子系統以及mRNA電轉等方法轉染T細胞，使得T細胞表面表達嵌合抗原受體(CAR)，從而特異性識別和結合腫瘤細胞表面的抗原並裂解腫瘤細胞。而為了提高轉染效率，通常需在T細胞激活期間進行轉染。

CAR-T細胞體外擴增

CAR-T細胞體外擴增至治療劑量，一般一個病人需要幾十億，乃至上百億個CAR-T細胞(患者體型越大，需要的細胞就越多)。

Morphology of Activated andexpanded T cells stimulated with CD28/CD3 beads(圖片來源ProMab Biotechnologies)

CAR-T細胞回輸

CAR-T細胞擴增完成之後，需要通過冷鏈運輸到患者所在醫院，研究人員須將細胞濃縮至一定體積回輸給病人。

值得注意的是，冷鏈運輸以及低溫存儲在這一過程中扮演著不可或缺的角色。同時，由於細胞免疫治療很有可能未來的商業模式為一中心覆蓋多區域，因此強大的細胞冷鏈物流顯得極為重要。意識到這一點，諾華、Kite Pharma、Bluebird Bio、Bellicum Pharmaceuticals、ProMab等細胞治療領域的佼佼者紛紛與領先的低溫物流解決方案供應商CryoPort公司建立了合作關係。

冷鏈運輸(圖片來源 scorrmarketing.com)

另外，考慮到患者病情已經到達晚期，每拖延一天就會耽誤治療時間。因此，時間也是最為關鍵的一個環節。其中Kite公司從提取患者細胞，到CAR-T細胞回輸進患者體內，這一過程大約需要16-18天(也可能縮短到14天)的時間，諾華的製備時間為22-29天，Juno的製備時間為24天。

嚴密監測

CAR-T療法本質上是一種細胞工程化的「活藥物」，其回輸劑量控制很大程度上取決於病人體內的腫瘤負荷，而這與傳統藥物的劑量控制理念完全不同。

Real-time Cytotoxicity Assay (RTCA) with ProMab and Company Abeads.CAR-T cells expanded with ProMab』s beads had higher cytotoxic activity(圖片來源ProMab Biotechnologies)

另外，由於CAR-T療法殺癌細胞實在是太快太有效了(瞬時殺傷能力)，所以瞬間會在局部產生超大量的細胞因子，引起驚人的免疫反應，也就是所謂的細胞因子風暴(CRS)。是目前最常見的CAR-T細胞注射後的副作用，同時也被認為是CAR-T細胞治療在體內「發揮作用」的標誌。

但嚴重時甚至會危及生命，因此這也就是為什麼CAR-T療法的最後一步是嚴密監護，作為一種廣受關注的新療法，與療效同樣重要的是副作用的防控。

當然在細胞輸入之前，應該擁有一些列的開展類似「藥物敏感試驗」的類似試驗，在體外就確定工程化的T細胞是否對病人癌細胞有殺傷效果，同時藉助相關技術，有效的嚴密監控CAR-T細胞在病人體內/外的生存周期也至關重要。

綜上所述，如果將CAR-T細胞作為一款產品來開發的話，所面臨的問題還是挺多的。既沒有現成的標準可以指導臨床前階段的藥學、藥理、葯代、藥效和毒理特點的評估，也沒有標準可以用於CAR-T的規範化生產、製備和質控環節，而最大的挑戰是如何從科研機構走向質量高度可控的生產中心，如何低成本高質量的工業化生產。

CAR-T細胞生產工藝

視頻來源 kite官網

https://v.qq.com/x/page/l0524vxqu7l.html

因此，這些看似簡單的步驟的合理安排是至關重要的。

目前，CAR-T之熱已經席捲了全球，中國更是僅次於美國，開展的CAR-T臨床試驗數量位居全球第二。但眾多企業與科研團隊的合作仍在艱難的將CAR-T療法推向產業化，為了能夠加快國內CAR-T行業的發展，與專業CAR-T研發團隊的強強聯手或是明智之選。而國內能提供這樣高水準、規範化的CAR-T細胞製備以及完善臨床整體治療方案的CAR-T公司並不多。

Transition to Commercial Manufacturing(圖片來源 cell.com)

今天我們為大家推薦一家有著多年豐富的CAR-T和抗體研發企業—ProMab Biotechnologies Inc。ProMab 現可提供CAR-T研發全套產權CRO服務，以及CD28/CD3 T細胞激活磁珠、實時定量細胞質控檢測系統、CAR-T細胞培養基等各種免疫治療輔助試劑和標準化細胞監控設備，公司也正在中國進行相關CAR-T細胞磁珠的試用等活動，歡迎感興趣的嘗試聯繫。

聯繫人：

ProMabBiotechnologies, Inc. Richmond, CA 94806, USA.

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