幹細胞-組織器官再生的新希望

肝臟移植作為治療終末期肝病唯一有效的方法已得到世界公認，目前肝移植術後5年生存率可達70.5%，但其應用受到供體數量的制約。據我國衛生部統計，每年有150萬患者等待接受肝移植手術，然而每年施行的手術量僅約1萬台，供體器官數量嚴重缺乏的現狀亟待解決。隨著肝臟器官再生研究的深入及幹細胞-組織工程技術的發展，幹細胞為肝臟組織器官再生帶來了新的曙光。本刊特邀請中山大學附屬第三醫院楊揚教授針對目前幹細胞--組織器官的最新進展進行綜述，以饗讀者。

幹細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞，其中多能幹細胞可分化為全身各種細胞、組織，包括胚胎幹細胞（embryonic stem cells，ESCs）及誘導性多能幹細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）兩大類。在體外誘導多能幹細胞定向分化形成功能完善的細胞、組織、器官是其進一步臨床應用的基礎。目前已有大量定向分化為特定功能細胞類型的報道，包括神經、血管內皮組織、肝細胞樣細胞、心肌細胞、造血細胞等。進而逐步向體外生成類器官乃至實質器官邁進。目前利用多能幹細胞生產人類組織器官的主要方法有：生物材料支架構建組織工程器官、脫細胞組織/器官支架構建組織工程器官、幹細胞分化成為類器官樣組織、通過嵌合體生產人類組織器官。

生物材料支架構建組織工程器官

該方法利用高分子材料預先構制鑄型為細胞生長提供附著點和微環境支持，以期維持特定的三維形態結構或發揮特定生理功能，從而形成臨床可應用的人工器官。早期研究顯示使用高分子可降解材料經耳形壓模，製成耳廓支架，然後將牛軟骨細胞接種於支架，經體外培養1~2周後植入裸鼠背部皮下可形成具有3D結構的新生耳廓組織。而將肝細胞在生物材料上形成的組織片移植到小鼠體內可發揮類似的生理功能。而iPSCs的發現，極大的豐富了該技術的細胞來源。生物支架具有生物相容性、可降解、基質孔徑可控並促進血管生成的優點，結合自身來源的iPSCs定向分化的細胞種植，所構建的人工器官可有效避免移植排異反應的發生，具有獨特的優勢。

脫細胞組織/器官支架構建組織工程器官

器官的脫細胞化是指在維持原器官總體形態的基礎上，通過灌注洗脫器官內實質細胞而保留含有脈管結構的細胞基質骨架的過程。人工氣管移植治療終末期氣管軟化症作為該技術的先驅首先應用於臨床。將供體氣管上細胞及MHC抗原分子洗脫，接種上受體來源的上皮細胞和間充質幹細胞分化而來的軟骨細胞，而後移植給受者，成功避免了免疫排斥反應並獲得了可喜的療效。在肝臟再生研究領域，研究發現利用傳統的培養基培養肝細胞的過程中，肝細胞的功能及表型會快速丟失。體外培養完整肝臟器官必須解決細胞存活及代謝所必須的能量供給和物質轉運問題，首先要構建細胞生長所必須的血管網及其依附的基質骨架。由於肝臟基質組分繁雜，結構精細，在體外人工直接構建肝臟基質骨架難以實現，而通過洗脫供肝實質細胞獲得骨架更具可行性。Uygun等首次報道了利用脫細胞化的肝臟成功製備了可供移植的再細胞化人工器官。移植的肝細胞利用基質骨架所保留了血管網結構，經體外灌注培養後植入體內，能夠維持在原位並發揮功能。因此，脫細胞骨架可以誘導細胞遷徙、定位、分化，並為細胞的增殖提供必要的基礎構架及營養供應。目前研究多基於原代肝細胞及胎兒肝細胞的再細胞化，臨床大規模應用受到可獲取的細胞數量及倫理限制。幹細胞誘導分化肝細胞已獲得成功，為構建再細胞化人類完整肝臟所需的大量肝臟細胞提供了潛在的來源，特別是iPSCs誘導的具有個體特異性的肝細胞，可有效避免排斥反應，是極具潛力的供移植應用的細胞類別。

幹細胞分化形成類器官樣組織

隨著細胞培養技術的進步，研究發現，在3D Matrigel中培養的細胞可分化為類器官，肝臟類器官亦被成功培養，其細胞懸液經脾內注射後可於受體肝臟內增值分化出含肝細胞及膽管細胞的團塊。Takebe等誘導iPSCs直接分化為肝臟內胚層細胞（iPSC-HEs），而後與臍靜脈內皮細胞（HUVECs）及間充質幹細胞（MSCs）共同培養，形成肝芽，接著異位移植於免疫缺陷小鼠腹腔內，最終形成血管化的類肝器官並發揮肝臟的代謝功能。該發現開創性的在體外成功演繹了器官發生過程，為培養具有個體特異性的可供移植的肝臟帶來了新的希望。由於類器官的形態及功能與機體發育正常的器官間仍有較大差距，目前僅適用於器官發生學研究、疾病模型的構建以及生理、病理和藥物毒理學相關研究。

通過嵌合體生產人類組織器官

1984年，Fehilly等人構建了遺傳距離更遠（約4％）的山羊與綿羊的嵌合體，在毛色、體態、組織器官等方面均表現出不同程度的嵌合，同時嵌合體還可以長期存活，未發現明顯異常。2008年,項鵬等報道了建立了基於Apodemus sylvaticus/ Mus musculus兩個物種（遺傳上的差距是18％）的異種嵌合體動物模型[16]。這些研究提示有可能建立人和猴的嵌合體，利用猴生產人類器官。進年發現的新型的基因編輯載體TALEN和CRISPR/Cas9為精準、高效的非人靈長類動物基因敲除提供了有利武器。近期，項鵬課題組利用該技術成功構建了食蟹猴MCPH1突變模型及Shank3突變的自閉症模型等靈長類動物模型。同時研究證實食蟹猴ES細胞可在豬體內發育形成猴豬嵌合體。由於正常動物體內嵌合率較低，難以形成完整器官，因此，可以考慮利用猴基因缺陷模型，抑制受體特定器官的分化、發育，使得植入的細胞形成增殖優勢，實現定向的器官再生。同時使用神經特異/生殖細胞特異啟動子攜帶自殺基因，避免倫理問題。該構想為人工器官的生產提供了新的思路。

綜上所述，幹細胞-組織工程技術在近年取得了長足的進步，為解決器官短缺問題提供了新的思路。

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