免疫組化步驟、結果分析及注意事項……
作者：解螺旋科研大V團隊
導語
實驗室花花師姐正在教導新來的師弟：「想拿高分文章，不學免疫組化怎麼行？」免疫組化王子毛博旁邊插話：「是這個理，今天我就豁出去，將我十多年的心得和經驗奉獻給小師弟你了。」小師弟感激涕零，唯諾細聽兩位前輩的教誨......
免疫組化，免疫組織化學技術（immunohistochemistry），是一項利用抗原抗體反應，通過使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原，對蛋白定位，定性的實驗技術。
免疫組化主要用的是組織標本和細胞標本兩大類，組織標本包括石蠟切片（病理切片和組織晶元）和冰凍切片。石蠟切片，對組織形態保存好，保存時間也長，雖然對組織抗原暴露有影響，但可以抗原修復，所以石蠟切片仍然是首選的標本製作方法。
免疫組化步驟詳解
免疫組化結果分析
很多時候，我們千辛萬苦地染出了一張張漂亮的免疫組化片子。但是卻不知道如何正確地分析，得出理想的結果。這實在是一件憾事。如下圖，正常的結果應該是這樣的：鏡下細胞核呈藍色，陽性結果呈深淺不一的棕色。
結果分析主要有兩種方法，陽性著色細胞計數法和評分法。前者是在40*光鏡下，隨機10個視野下計數陽性著色細胞；後者則是在光學顯微鏡下按染色程度（0分陰性著色，1分淡黃色，2分淺褐色，3分深褐色）和陽性範圍（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）評分，最終分數相加。
免疫組化結果分析是毛博的特長，以下是他傳授的獨門絕技。
1.對照染色
和做實驗的時候必須設立對照組一樣，免疫組化也必須設立對照染色。沒有對照染色的免疫組化結果是不可信的。對照一般有陽性組織對照，陰性組織對照，陰性試劑對照，自身對照。一般來說，有一個陽性組織對照和一個陰性組織對照就足夠了。
2.定位
抗原表達必須在特定部位。如LCA應定位在細胞膜上；CK應定位在細胞漿內；PCNA及p53蛋白應定位在細胞核內等等。不在抗原所在部位的陽性著色，不能視為確切的陽性結果。有可能是非特異性染色或者假陽性。不能確定怎麼辦？這就要用到上一段提到的對照染色了。
3.半定位
現在一般用圖像分析系統進行定量。如果你的實驗室不幸沒有那麼高大上的話，就只好趕鴨子上架，用肉眼定一下量了。因為人為主觀性比較強，所以只能稱作半定量。免疫組化的半定量一般就分為三級：弱（+），中（++），強（+++）。以綠色免疫熒光為例，則表現為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱（+）=1，中（++）=2，強（+++）=3。至少隨機觀察5-10個HPF。然後根據（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3計算出數值；總數值1.5者為(+++)。
4.圖像分析儀
如果要進行精確定量的話，就要用到圖像分析儀。圖像分析儀類型很多。這裡就不一一介紹了。其實毛博最想隆重推薦的是一款圖像分析軟體：Image J。毛博當年在米國做博士猴的時候，就是用的這款軟體。這是NIH開發的免費軟體。一般的免疫組化結果分析用它就綽綽有餘了。現在已經開發到了1.50版。網上可以免費下載。其界面非常簡潔，如下圖所示。
現在，根據一個實例來看看如何用Image J來進行圖像分析。如下圖所示，我們有一張細胞的免疫熒光染色的照片。那麼，如何用Image J來計數細胞的個數呢？
首先，要把彩色的圖像轉換成黑白圖像。步驟如下：ImageType16-bit。轉換成黑白圖像後，將要計數的部分用高亮標示出來。步驟如下：ImageAdjustThreshold。然後拖動滑鼠，直到所有的細胞被標示出來。
有時候2個細胞靠得比較緊密，會被計數為1個細胞。這個時候可以採用Image J的水洗功能。步驟如下：ImageBinaryWatershed。如下圖的藍色箭頭所示，這些是本來計數成一個的細胞，經過水洗之後，更加精確地被計數成了2個細胞。
然後，就可以正式開始分析了。步驟如下：AnalyzeAnalyze Particles。在得出最後的結果之前，還有一些選項需要選擇。如果想要計數全部的細胞，那麼Size項裡面選擇「0-infinity」。Circularity的默認值為「0.00-1.00」。一般就取默認值。
最後的結果如下圖所示。軟體自動測量了每個細胞的大小。這裡因為是二維圖像，所以就是每個細胞的面積。然後計數了一共有72個細胞，總面積為21286.00，平均大小為295.64。
免疫組化是個苦活，時間長，步驟多，還要經常接觸有毒致癌物質。大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子，最後都希望得出自己想要的結果。以上，毛博介紹了一些自己的心得體會。希望廣大的實驗狗們都能做出自己想要的結果，早點發文章。
非特異性染色的八大原因
然而，結果卻未必都是那麼如意的，常常出現下面這種狀況，好好的一張片子染得臟髒的，這就是最常見的非特異性染色。
1. 抗體問題，真的是一分錢一分貨啊！
一抗用多克隆抗體容易出現非特異性染色，建議用高純度，高效價的針對更具特異性抗原決定簇的單克隆抗體來解決。單克隆抗體很貴，不過結果真的很好。尤其是背景非特異性染色不會太深。真是一分價錢一分貨。一抗過期也會造成杯具，所以要注意抗體的有效期。
2. 抗體濃度過高/孵育時間過長
一抗濃度太高也是出現非特異性染色的常見原因。解決的辦法就是預實驗。每次使用新抗體前應該多做預實驗，摸索出最理想的工作濃度，不能簡單地按照說明書來用。另一個常見原因就是孵育時間過長。解決的辦法就是定時器。加上抗體後，立刻調好定時器，提醒自己及時終止反應，就會避免這個問題。
3. DAB染色時間太長/變質
DAB的孵育時間過長，會造成背景非特異性染色。DAB的顯色時間不是一成不變的，主要靠自己在顯微鏡下盯著，一旦出現淺淺的棕色的時候，就要馬上沖洗。出現棕色的時間過短，表明抗體濃度過高；出現棕色的時間過長，表明抗體濃度過低。DAB要保存於避光乾燥的地方，現用現配，臨用前才加入H2O2。圖1就沖洗的有些晚了；圖2就是剛剛好，染色效果棒棒噠!
4. 內源性酶和生物素
內源性酶和生物素也會造成非特異性染色，特別是一些內源性酶生物素含量豐富的組織，如肝臟，腎臟，脾臟等。處理的辦法為：滅活鹼性磷酸酶：最常用的方法是將左旋咪唑（24 mg/mL）加入底物液中，並保持PH值在7.6-8.2，即能除去大部分內源性鹼性磷酸酶；對於酸性磷酸酶，可以用50 mmol/L的酒石酸抑制；對於內源性過氧化物酶，可以用0.9%的雙氧水來滅活。對於內源性生物素，染色前將切片浸於25 μg/mL親和素溶液中15分鐘，PBS清洗15分鐘後即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分鐘。
5. 組織變干
一下子染太多片子的時候，容易出現這種情況。解決的辦法就是不要貪多嚼不爛。一次少染幾張。還有就是試劑充分覆蓋組織，超出組織邊緣2 mm。然後用PAP筆在組織周圍畫一個圈圈，把修復液圈在裡面。避免修復液流走。圈圈應該距離組織邊緣3-4 mm。
6. 浸泡時間過長
切片在緩衝液或修復液裡面浸泡過夜，也會引起杯具。這都是偷懶的做法。但是有時候也是可以偷一下懶的。毛博的獨門秘技就是4°C冰箱。只要把容器放在4°C冰箱里，過夜完全沒有問題。
7. 清洗不充分
清洗一定要充分。PBS液一定要雙蒸水新配，用之前再次測PH值。緩衝液用0.05 mol/L的Tris-HCL，0.15 mol/L的NaCl即可。如果加一點去垢劑Tween-20就更好了。
8. 封閉血清問題
是否選擇了正確的封閉血清。原則是選擇二抗動物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要選擇非免疫羊血清。用PBS稀釋為3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30分鐘。這裡不用洗，直接甩掉即可。毛博再貢獻一個獨門絕招，直接用奶粉也可以。用5%的脫脂奶粉就可以了。而且效果還不錯。怎麼樣？簡單吧。
師傅領進門，造化看個人了。
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