基因修飾動物：恩澤世界的幕後英雄
目前，最有潛力打入醫療市場的基因修飾哺乳動物是豬。圖片來源：flickr
編者按：
轉基因作物的各種流言甚囂塵上生生不息，世人卻鮮聞基因修飾動物。其實，基因修飾動物這類技術已經發展了四十多年，默默在各個領域發揮著巨大的作用。
撰文 |唐騁（中科院上海神經科學研究所博士生）
責編 | 程莉
提到轉基因，或者基因修飾之類的術語，十個人腦中怕是有九個所想到的，都是那些在網上激起無數口水仗的各類轉基因農作物。然而，人類製造種類最多、基因操作最複雜並且對這個世界貢獻最大的基因修飾生物恐怕並不是那些在農業領域掀起變革的植物，而是動物。
基因修飾動物看似鮮為人知，其實無處不在。
病毒：
基因修飾動物的第一槍
我們已經知道，人類身上大約有5-8%的基因源自於病毒。事實上，不止人類，在目前所知的幾乎所有動物身上都發現了來自於病毒的基因成分[1]。病毒就像是一個個運送基因的「快遞小哥」，但病毒可不像一般的快遞小哥那樣遵紀守法，它說要把基因塞給細胞，細胞就非得接受不可。而這些強塞給細胞的基因中有一部分可以 「幸運地」嵌入到生殖細胞或早期胚胎的基因組中，從而世世代代流傳下去。
這其中的一些病毒基因甚至能反客為主，變成宿主不可分割的一部分。比如說人類懷胎十月，母體的免疫系統居然在那麼長的時間裡都不排斥龐大的胎兒，這裡面就有內源性病毒基因的功勞。生物在演化的漫長曆程中遭遇過無數病毒的感染，便點點滴滴地納入了無數病毒基因，將一次次偶然的感染銘刻到了這個物種的血脈之中，也一點一點地改變了自身，讓我們成了現在這個樣子。
大自然能做到的，人類往往能更加高效地做到，這就是科技。
1974年，美國兩位科學家碧翠絲·明茨（Beatrice Mintz）和魯道夫·耶內施（Rudolf Jaenisch）受此啟發，他們將人工提純的高濃度病毒注入小鼠囊胚，成功地將病毒基因整合進了小鼠的基因組，這是人類歷史上第一次通過生物技術手段獲取基因修飾過的動物[2]。
利用胚胎病毒注射法獲取基因修飾動物的一般流程（以小鼠為例）。圖片為作者自製。
病毒本身結構簡單，容易改造，人們既可以消除病毒的侵染性，讓病毒完成傳遞基因的使命後便功成身退，不再能繼續感染；更可以在病毒的基因組中摻雜進自己的私貨，讓病毒帶著我們想要的基因侵染動物，從而將指定的基因轉入動物體內。理論上，利用特殊改造的病毒既可以把人類所選擇的任何基因轉入動物體內，而對於基因修飾動物自身以外的動物和人不會有任何風險。
利用胚胎病毒注射法獲得的綠色熒光小鼠。圖片來源：上海南方模式生物研究中心
但是病毒並不是個足夠完美的工具。既然是運送基因的快遞，病毒的「包裹容量」總是有限的，就像你網購點吃喝玩樂的小東西沒啥問題，但要是哪個土豪想買艘遊艇，那恐怕就沒哪個快遞小哥可以勝任了。事實上，動物大多數基因對病毒而言都過於巨大，無論「打包」得多麼精巧也不可能塞進病毒那小小的外殼當中。
此外，病毒不但會強迫細胞接收快遞，送起快遞來還特別暴力，它總是不顧三七二十一地把DNA片段隨便插入到宿主基因組中，插在哪裡，插入多少都只能聽天由命，甚至還可能因為「暴力操作」而損壞細胞原有的基因組，這也是某些病毒特別容易引發癌症的原因之一。因此儘管直到今天我們偶爾還是會像當初那樣，直接把病毒注入胚胎（或受精卵）來製作基因修飾動物，但是這類技術太過粗糙，註定不能滿足現代對基因修飾動物的大部分技術要求。
胚胎幹細胞體外培養：
真正的動物基因修飾技術
事情到了1981年才迎來轉機，那年劍橋大學的生物學家馬丁·埃文斯爵士（Sir Martin John Evans）與馬修·考夫曼（Matthew H. Kaufman）[3]，和美國加州大學教授蓋爾·馬丁（Gail Roberta Martin）[4]幾乎同時發明了小鼠胚胎幹細胞的體外培養技術。
胚胎幹細胞是個神奇的東西，它可以變化成生物個體全身上下任何一種體細胞。雖然胚胎幹細胞沒法像受精卵一樣直接發育成一個動物個體，但是科學家發現，如果把胚胎幹細胞注入到早期胚胎當中，這些胚胎幹細胞就會像滴入清水中的墨水一般「摻」進胚胎當中，與胚胎原有的細胞混在一起，你中有我，我中有你，再也分不開了。最後就會生出一個包含兩種來源細胞的「混合個體」，這種動物體內一部分細胞來自原來的那個早期胚胎，還有一部分則來自科學家注入的外源性胚胎幹細胞，兩撥細胞雖然非親非故，但是卻可以在一隻動物體內和諧共處，我們一般稱這樣的動物為「嵌合體」。
不同毛色小鼠的胚胎幹細胞摻在一起而產生的嵌合體小鼠。圖片來自維基百科
這樣一來，科學家可以先在培養皿中培養胚胎幹細胞，然後再利用病毒等工具對這些胚胎幹細胞進行基因操作。由於胚胎幹細胞是一種像癌細胞一般的「不死」細胞，所以如果需要轉入的基因太大，就可以把基因拆分成幾份，分多次轉入細胞。不但如此，科學家還可以從成千上萬的胚胎幹細胞當中篩選出基因操作效果最好、最貼近科學家目標的那一個細胞拿出來單獨培養、複製，然後將這些經過基因修飾的胚胎幹細胞注入動物胚胎當中，即可得到含有基因修飾過的細胞的嵌合體。
[注]除了病毒以外，我們還有諸如鈣轉法、脂質體法、微囊泡融合法等工具，不過這些工具的目的和病毒一樣，都是把外源性基因轉入細胞內部，因此就不多作贅述了。
利用囊胚注射法獲取基因修飾動物的一般流程（以小鼠為例）。圖片為作者自製。
1985年，英國科學家奧利弗·史密斯（Oliver Smithies）率先推出一種被稱為「同源重組」的技術，實現了對基因的精確編輯[5]。之後在1986年，美國科學家馬里奧·卡佩基（Mario R. Capecchi）結合胚胎幹細胞體外培養技術和同源重組技術，製造出了世界上第一隻精確基因編輯的小鼠[6]。
雖然這類精確基因編輯往往效率極低且成本高昂，但這畢竟是人類從粗糙的「轉基因」跨入精確的「基因編輯」的第一步。2007年，因為在基因編輯上的突破性工作，馬里奧·卡佩基、馬丁·埃文斯爵士和奧利弗史密斯共同獲得了當年的諾貝爾生理學或醫學獎。
直到現在，利用胚胎幹細胞囊胚注射依然是製造小型基因修飾動物的主流方法之一，幾乎每個基因學實驗室里都會有用此方法製作的基因修飾小鼠。然而嵌合體受制於技術，體內含有兩種不同來源的細胞，其中幾乎必然有一部分細胞不帶有科學家所需的基因修飾，所以人們一般需要將其雜交幾代後才能真正獲得想要的動物個體，對於生育周期很長而且生育個數少的哺乳動物而言，這種技術還遠遠不夠。比方說如果用這種方法製造一群基因修飾牛，恐怕需要十年乃至更長的時間，顯然無論是商業還是科研都很難承受這樣的時間成本。
克隆：
基因修飾大型動物的新時代
終於到1996年，蘇格蘭一隻名叫「多莉」的小羊解開了這個死結，也讓世人無不聽說了一種叫做「克隆」的新技術。克隆技術能夠把一顆細胞直接變成一個動物個體，大大縮短了基因修飾動物的製作周期。如今，世界上絕大多數基因修飾的豬狗牛羊等大型動物都是用這種方法製作的。例如我國的畜牧業專家賴良學就曾經領導團隊用克隆技術製造出了抗豬瘟的基因修飾豬。
利用克隆獲取基因修飾動物的一般流程（以小鼠為例）。圖片為作者自製。
至此，那位壞壞的「快遞小哥」終於在各種科技加持下「從良」了。
CRISPR/Cas9系統：
史上最強的基因編輯工具
病毒之類的工具的終究是「快遞小哥」，它們只是負責把快遞送到細胞內而已，所以要給細胞內塞點基因進去不難，但是若想要精確刪除或者修改細胞內的基因就沒那麼容易了。那麼如何才能讓快遞小哥兼職「裁縫」呢？
2012年，來自加州大學的詹妮弗·杜德娜（Jennifer Doudna）[7]和來自麻省理工大學的張鋒[8]各自設計出了一種極為強大的基因編輯工具CRISPR/Cas9系統。這個系統可以按照設計者的意願進入細胞核內，對細胞的基因組進行增加、刪除以及修改等一切編輯操作。CRISPR/Cas9系統的強大是跨越時代的，從此CRISPR/Cas9系統近乎成了基因編輯的代名詞。
這下事情就好辦了，只要把「快遞小哥」包裹中的基因換成CRISPR/Cas9系統，那麼科學家就可以隨心所欲地編輯基因了。這就好比直接把一個智能機器人快遞給細胞，只要快遞小哥準確送貨到家，接下去的工作只要交給這個智能機器人便可以了。2014年，當初製造出世界上第一隻基因修飾動物的科學家魯道夫·耶內施時隔四十年後又在其實驗室中製造出了第一隻利用CRISPR/Cas9系統創造出的基因修飾動物[9]。
基因修飾動物的先驅，魯道夫·耶內施。圖片來自維基百科。
如今，CRISPR/Cas9系統、胚胎幹細胞體外培養技術和克隆技術已是製造基因編輯動物的三大支柱技術。終於，科學家遠遠走在了大自然的前面，可以近乎隨心所欲地編寫動物的基因組了。
神兵既出，接下去就要看看其鋒芒了。
幕後的醫療變革推手
與基因修飾的植物不同，基因修飾動物在農業方面的應用極少，唯一值得一提的大概是美國FDA批准了一種生長較快的轉基因三文魚進入市場[10]，這是迄今為止唯一被批准上市的食用基因修飾動物。這一點並不難理解，民眾對轉基因農作物尚且有這麼大反應，就更別提這些還有著動物倫理、人畜共患病等一大堆「死結」的基因修飾家畜了。但從另一方面來說，基因修飾動物的主要價值也並不在農業上，這是基因修飾動物產業依然蓬勃發展的內在原因，而這同時也讓基因修飾動物不容易進入民眾視野，得以躲避輿論的喧囂。
數十年來，絕大多數實驗室製造基因修飾動物模型都是出於科研目的。我們製造出癌症、老年痴呆和糖尿病動物模型，大大加速了臨床醫學的發展；我們有針對性地減少或增強某些基因的效果，從而得以從分子級別上理解各種基因的意義；我們將某些動物基因替換為人類基因，製造出「人源化」動物模型，從而讓這些動物可以患上人類疾病，並能對各種藥物產生與人類更加類似的反應，從而規避人體試驗的風險。此類種種，經過科學家數十年的辛勤勞作，帶來了不計其數的新型治療手段和重大科研突破。
肥胖症小鼠模型（右）與正常小鼠（左），通過基因編輯可以讓小鼠變得「喝口涼水都長肉」，我們現在之所以能知道肥胖的成因以及對身體健康的種種影響，很大程度上就是依靠對這類小鼠的研究。圖片來源：上海南方模式生物研究中心
而今，因為CRISPR/Cas9為代表的新一代基因編輯技術的發明，我們能夠對基因施以更加精細更加複雜的操作，這一切正在啟動著醫療技術新一輪的革命。 通過對基因修飾動物的反覆研究，基因治療已經不再是一個科幻小說中的概念。
杜興氏肌肉萎縮症（Duchenne Muscular Dystrophy）曾經是一種無藥可救的惡性遺傳疾病，患病者由於自身的基因缺陷，從出生開始就會遭遇不可逆轉的肌肉萎縮，最終在很年輕的時候因呼吸肌衰竭窒息而死。但是在2016年初，來自三個機構的多個研究組通過將含有CRISPR/Cas9系統的病毒注入患有杜興氏肌肉萎縮症的動物體內，結果成功地修復這些動物有缺陷的基因，繼而大大提高了它們的預期壽命和生活質量[11[12][13]。
甚至對於某些疾病的治療技術已經完成了動物實驗，邁進了臨床階段。就在不久前，斯坦福大學的科學家發明了一種新技術，可以將患有鐮刀型細胞貧血症（sickle-cell disease）患者的造血幹細胞抽出來，在培養皿中用基因編輯技術加以修復，然後回輸給患者[14]。藉由這樣的「換血」，對這種絕症的治療已即將成為人類醫學歷史上的另一場漂亮的硬仗。
除此以外，還有多種嚴重遺傳病，乃至後天性的腫瘤、心腦血管疾病和神經退行性疾病都在被征服的路上。可以說，基因修飾動物已經在延長世界上每一個人的預期壽命，而你我都會是這次醫學革命的受益者。
生於科技，勝於科技
對於任何國家而言，器官移植都是極為棘手的問題。其實不止是器官，任何來自於人體的生物成分都面對著同樣的問題，對血漿、白蛋白、免疫球蛋白等等無窮無盡的需求與捉襟見肘的供應，讓無數病患在煎熬的等待中結束了生命，更讓器官黑市和地下血站成了人類文明社會的毒瘤。
然而，基因修飾動物正在讓這一切成為歷史。
2014年，中國科學家張普民和他的研究團隊利用基因編輯技術，成功製造出了能夠產生人類白蛋白的轉基因豬[15]。而來自美國哈佛大學的楊璐菡團隊則更進一步，他們採用大規模基因編輯技術，試圖讓經過基因編輯的豬直接產生人類的器官[16]。但畢竟臨床醫學對安全性和有效性有著異乎尋常的嚴格標準，所以這些正在研發中的技術還有很多瓶頸需要突破。然而曙光已經出現在地平線上了，如今，擁有這些技術專利的企業已經獲取了數億美元的風投和政府資助，這場變革也許會在我們有生之年悄然而至。
在某些領域，基因修飾動物已經讓動物超越了「動物」的概念，變成了某種「生物反應工廠」。我們將大腸桿菌等微生物作為「生物反應工廠」已有數十年的時間，但微生物畢竟個體小，又比較「嬌氣」，使用起來不但需要構造複雜的發酵罐，從中提取其生物反應產品也需要費一番功夫。
如果將動物用於生物反應，情況將大有改觀。動物不但飼養容易，更重要的是，提取來源於動物的生物反應產品會更加容易。中國人養蠶已經有好幾千年的歷史了，我們可以從蠶寶寶身上獲取我們所需的蠶絲，每條蠶可以產生大約一克蠶絲，而蠶絲的成分則是純度高達80%以上的蠶絲蛋白。試想一下，如果我們修改了蠶的基因，讓它吐出的不是蠶絲蛋白而是人類的免疫球蛋白，甚至是更昂貴的單抗藥物蛋白，那意味著一條蠶的產量就足以把一萬個癌症病人從死亡線上拉回來，那世界將會變成怎樣一副光景？
事實上，這並不是想像，目前全世界已經有無數家公司和研究機構正在著手開始這方面的研究了。
機遇，風險與未來
任何一個生物技術的從業人員都明白，生命技術的大規模產業化就在眼前，這必將帶來極其巨大的財富與洶湧澎湃的經濟結構轉變，科學家，企業家都將在這場經濟結構轉型的浪潮中成為冒險家。然而機遇與風險乃至亂象從來都是不分家的。
與被放在聚光燈下接受無數人審視的轉基因作物不同，基因修飾動物的商業化反而處於一種近乎「野蠻生長」的狀態，各種投機之下難免出現很多資本胡亂擴張的問題。去年，天津市某生物技術公司高調宣布要建設「全球最大的克隆工廠」，不但要生產各種商業化的克隆動物與基因修飾動物，甚至還宣稱要短期內攻克靈長類克隆之類的世界性難題[17]。結果不到半年時間，這個雄心勃勃的計劃便在一片質疑中成了個爛尾工程。
而反觀政府這邊，世界則陷入了兩種不同的極端。中國和美國至今也沒有公布足以規範基因修飾動物市場的行業規範，歐洲議會則乾脆宣布徹底禁止任何克隆動物的商業化，這實際上也禁絕了基因修飾大型動物的商業運作。對於一個新興的產業，無論是放任自流還是一刀切式的懶政，恐怕都不是合理的做法。
技術也好，資本也罷，一切都是中性的，無所謂善惡，而能夠決定其善惡的終究是站在這一切背後的人類，我們。面對一個前所未有的事物，我們沒有任何經驗可遵循，而每每這種時候，卻是考驗我們智慧的時代節點，正是這種智慧，讓我們人類文明成功發展到了今天。
生命之路，道阻且長，讓我們擁抱那光明的未來，也讓我們留心那暗藏的荊棘。
參考資料：
1. Belshaw R, Pereira V, Katzourakis A, Talbot G, Paces J, Burt A, Tristem M (April 2004). "Long-term reinfection of the human genome by endogenous retroviruses". Proc Natl Acad Sci USA. 101 (14): 4894–9.
2. Jaenisch R, Mintz B (1974). "Simian virus 50 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (4): 1250–1254.
3. Evans, M. J., & Kaufman, M. H. (1981). Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. nature, 292(5819), 154-156.
4. Martin, G. R. (1981). Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 78(12), 7634-7638.
5. Smithies O, Gregg, R. G., Boggs, S. S., Doralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal beta-globin locus by homologous recombination. Nature. 1985;317:230-4..
6. Thomas KR, Folger, K.R., Capecchi, M.R. High frequency targeting of genes to specific sites in the mammalian genome. Cell. 1986;44:419-28
7. Charpentier, Emmanuelle, and Jennifer A. Doudna. "Biotechnology: Rewriting a genome." Nature 495.7439 (2013): 50-51.
8. Zhang F et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. (2013) Science 339(6121): 819-823
9. Yang H et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. (2014) Cell
10. http://www.guokr.com/article/440946/
11. Nelson et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science DOI: 10.1126/science.aad5143
12. Long et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science DOI: 10.1126/science.aad5725
13. Tabebordbar et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science DOI: 10.1126/science.aad5177
14. Dever, D. P., Bak, R. O., Reinisch, A., Camarena, J., Washington, G., Nicolas, C. E., ... & Uchida, N. (2016). CRISPR/Cas9 β-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells. Nature.
15. Peng, J., Wang, Y., Jiang, J., Zhou, X., Song, L., Wang, L., ... & Liu, J. (2015). Production of human albumin in pigs through CRISPR/Cas9-mediated knockin of human cDNA into swine albumin locus in the zygotes. Scientific reports, 5.
16. http://www.yangtse.com/gd/2015-10-17/677422.html
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